TNF-α誘導PC12細胞凋亡及對bcl-2和bax mRNA表達的影響.pdf

1、目的：
　　 臨床研究和動物實驗表明，腦內神經炎癥與多種慢性神經退行性疾病如帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)和多發(fā)性硬化(MS)等的發(fā)生、發(fā)展密切相關。抑制神經炎癥反應能減弱受損腦區(qū)的神經元病變。
　　 腫瘤壞死因子α(TNF-α)在各種炎癥和免疫反應中由多種細胞分泌的一類多向性細胞因子。其在中樞神經系統(tǒng)急慢性炎性或變性病如缺血性腦血管病，PD，老年癡呆，肌萎縮側索硬化及多發(fā)性硬化中表達升高。TNF-α合成過量會導

2、致神經細胞出現(xiàn)病理性凋亡。
　　 以往認為TNF-α誘導凋亡的通路只有通過死亡受體通路，目前許多研究證明，凋亡通路也會通過線粒體途徑。在調控線粒體介導的細胞凋亡中，B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)家族蛋白及它們的相互作用發(fā)揮了重要的作用。
　　 bcl-2基因對線粒體膜的完整性具有保護作用，可能是此基因抗凋亡作用的主要機制。bcl-2基因表達增高，抑制細胞凋亡。凋亡基因bax則是Bcl-2家族的另一個重要成員，不但

3、可以促進細胞凋亡，而且是凋亡途徑關鍵環(huán)節(jié)。Bcl-2家族蛋白中促凋亡與促生存蛋白之間的相互作用控制細胞色素C等物質從線粒體釋放，對線粒體凋亡路徑發(fā)揮了十分重要的調控作用。
　　 PC12細胞作為神經元細胞模型，廣泛用于神經生理、病理及藥理方面研究。本實驗選用PC12作為研究對象，探討B(tài)cl-2家族基因是否參與TNF-α對PC12細胞的毒性作用。利用不同濃度TNF-α，分別作用于PC12細胞，并檢測同一濃度不同時間點PC12細胞的

4、凋亡相關基因bcl-2 mRNA和bax mRNA表達情況，希望能夠為研究和治療神經變性疾病以及TNF-α相關疾病的治療新策略提供有力的理論基礎。
　　 材料與方法
　　 一、PC12細胞培養(yǎng)
　　 PC12細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，其中含5％胎牛血清、10％馬血清，接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)箱內進行常規(guī)培養(yǎng)。
　　 二、生化指標的測定
　　 1

5、、MTT法檢測不同濃度TNF-α作用下PC12細胞生存率。
　　 2、Annexin V/PI雙染法經流式細胞儀檢測不同濃度TNF-α作用下PC12細胞凋亡率。
　　 3、Annexin V/PI雙染法經流式細胞儀檢測30ng/ml TNF-α作用下不同時間點PC12細胞凋亡率。
　　 4、30ng/ml TNF-α作用下不同時間點PC12細胞電鏡形態(tài)學觀察。
　　 5、Real time PCR法檢測不

6、同時間點PC12細胞bcl-2 mRNA、bax mRNA表達。
　　 三、統(tǒng)計學處理
　　 所有數據采用SPSS18.0進行分析，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1、不同濃度TNF-α對PC12細胞的影響結果
　　 細胞生存率隨著TNF-α濃度增加而降低，并呈濃度-效應關系。其中濃度為30ng/ml時細胞生存率為50

7、.65％，細胞凋亡率為41.64％。
　　 2、30ng/ml TNF-α作用下各時間點PC12細胞凋亡結果
　　 采用30ng/ml TNF-α處理PC12細胞，0h、6h、12h、24h后，Annexin V/PI雙染法經流式細胞儀檢測各個時間點PC12細胞凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)，30ng/mlTNF-α作用于PC12細胞24h時細胞凋亡率最高(P<0.05)。
　　 3、30ng/ml TNF-α作用下0h和2

8、4h時間點PC12細胞電鏡觀察結果
　　 未加藥組PC12細胞呈圓形，微絨毛豐富，胞漿內見粗面內質網，線粒體及糖原顆粒，核巨大且切跡明顯；24h組可見細胞核碎裂及細胞質空泡化，細胞膜光滑無突起，染色質濃集。
　　 4、30ng/ml TNF-α作用下各時間點PC12細胞bcl-2和bax mRNA表達結果
　　 采用real time PCR檢測bcl-2 mRNA和bax mRNA表達，結果顯示，與0h組相比較

9、，bax mRNA明顯上調(P<0.05)；與Oh組相比較，bcl-2 mRNA明顯下降(P<0.05)。
　　 結論
　　 1、隨著TNF-α濃度升高PC12細胞生存率降低，呈濃度-效應關系。
　　 2、在30ng/ml TNF-α濃度作用下，0～24h內24h時間點PC12細胞凋亡率最高(P<0.05)。
　　 3、TNF-α可降低PC12細胞中bcl-2 mRNA表達，同時增強bax mRNA表達，