手掌參GcGASA蛋白和突變體的表達、純化、氧化重折疊和抗菌抗氧化活性的研究.pdf

1、赤霉酸誘導的富含半胱氨酸蛋白在植物根生長、莖延伸，果實成熟等生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。雖然目前關于該類蛋白的二、三級結構未見報道，但是通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，該家族蛋白的C-末端含有12個保守的半胱氨酸殘基，分布情況是CX3CX3CX8CX3CX2CCX2CXCX11CPCX12C，其中CXXC結構域通常具有氧化還原活性。因此，本研究旨在利用原核表達系統(tǒng)獲取一種新型藏藥材手掌參中赤霉酸誘導的富含半胱氨酸蛋白的野生型（GcGASA）和突

2、變體，并研究其在體內、體外抗氧化活性和抗真菌活性。
　　方法：采用pET-28a(+)作為原核表達載體，構建重組質粒，并以此為模板通過PCR定點突變獲得突變體SS-GcGASA，經(jīng)IPTG誘導表達，及包涵體的變性復性獲得可溶性目標蛋白，并分別通過凝膠過濾和SDS-PAGE對融合蛋白進行純化和鑒定；采用檢測蛋白體外清除DPPH自由基和過氧化氫的方法來研究蛋白體外抗氧化活性，并通過檢測宿主菌抗過氧化氫損傷的方法來檢測蛋白體內抗氧化活性

3、。此外，采用瓊脂糖擴散分析法檢測融合蛋白及其突變體抗禾谷鐮刀菌的活性。
　　結果：測序結果表明：目標基因gcgasa成功插入表達載體pET-28a(+)，并引入兩個Ser突變位點；SDS-PAGE顯示IPTG誘導后的融合蛋白多以包涵體形式存在，通過對包涵體變性復性和凝膠過濾純化的方法獲得較高純度濃度的野生型和突變型目標蛋白；融合蛋白的體外抗氧化活性實驗結果顯示野生型蛋白在0.3 mg/mL濃度時具有較強的清除DPPH自由基的能力，

4、在有DTT還原劑存在的情況下，野生型蛋白在0.3 mg/mL的濃度時具有明顯清除過氧化氫的活性，且其活性與濃度正相關，但在此濃度下突變型蛋白卻沒有抗氧化活性；野生型蛋白的體內抗氧化活性的實驗結果顯示，與pET28a空載相比，過氧化氫對表達表達目標蛋白的宿主菌的損傷程度明顯要弱，尤其是加入高濃度的過氧化氫后，這種現(xiàn)象更明顯；融合蛋白的體外抗真菌活性檢測結果顯示，目標蛋白和突變體濃度為0.3 mg/mL時，對禾谷鐮刀菌有明顯的抑菌活性，而且