轉(zhuǎn)錄因子Satb2和Runx2在牙囊細胞和骨髓基質(zhì)細胞分化過程中的調(diào)控功能及其在骨與牙周創(chuàng)傷修復過程中的作用研究.pdf

1、本研究在體外分離培養(yǎng)并鑒定牙囊細胞分化潛能的基礎上，研究了Satb2在牙囊細胞向成骨細胞分化過程中的作用，并通過體內(nèi)牙周創(chuàng)傷模型明確了牙囊細胞、骨髓基質(zhì)細胞以及Satb2和Runx2在牙周組織修復過程中的作用，以期為牙周組織工程學篩選促進牙周再生的種子細胞和調(diào)控因子提供新的理論依據(jù)。 材料和方法： 第一部分：本實驗使用的轉(zhuǎn)基因小鼠mBSP9.0Luc/BACT-EGFP攜帶的外源性基因是小鼠BSP上游9.0 kb啟動子序

2、列調(diào)控的熒光素酶報告基因和β-肌動蛋白(β-actin)啟動子及巨細胞病毒增強子(cylomegalovims enhancer)調(diào)控的增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)。從已鑒定的5-7天齡的mBSP9.0Luc/BACT-EGFP小鼠中分離牙囊細胞，傳代培養(yǎng)。在體外以10-8mol/l地塞米松、10mmol/1β-甘油磷酸鈉、50mg/l維生素C)誘導牙囊細胞向成骨細

3、胞的分化，以茜素紅染色法檢測鈣化結節(jié)的形成；以10-8M地塞米松和6ng/ml胰島素誘導牙囊細胞向脂肪細胞分化，并用油紅O(Oil Red O)染色鑒定；以10-8mol/L地塞米松、10mmol/L維生素C和5μg/ml轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)誘導牙囊細胞向軟骨細胞分化，并以阿利新蘭染色鑒定。體外誘導實驗均以從6-8周大的mBSP9.0Luc/BACT-EGFP小鼠中分離的骨髓基質(zhì)細胞為對照； 第二部分：本實驗用原位雜交檢

4、測了小鼠胚胎14.5天時頜骨和牙胚中Satb2的表達；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將Satb2表達載體pcDNA3.1-Satb2轉(zhuǎn)入骨髓基質(zhì)細胞和牙囊細胞中以實現(xiàn)Satb2的過表達，并用半定量RT-PCR檢測骨特異性基因和成骨分化調(diào)控因子的表達；用逆轉(zhuǎn)錄病毒(pBABE-hygro-Satb2)感染小鼠成骨細胞系MC3T3，并用遷移速率實驗(Scratch wound assay)檢測Satb2過表達對細胞遷移速率的影響；為檢測Satb2對Os

5、x基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，將含有Osx全長啟動子(-2020/+13)的報告載體與Satb2和/或Runx2表達載體同時轉(zhuǎn)染入HEK-293細胞和MC3T3-E1細胞中，并檢測熒光素酶表達水平的變化；用逆轉(zhuǎn)錄病毒(pBABE-hygro-Satb2)感染mBSP9.0Luc/BACT-EGFP小鼠牙囊細胞(DFCs)和骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)，并將這些細胞植入B6D2F1小鼠的牙周創(chuàng)傷模型中，用H&E染色、免疫組化染色和組織學測量評價Sa

6、tb2過表達對牙周創(chuàng)傷愈合的作用。 第三部分：本實驗用H&E染色和組織學測量評價了6-8周的Runx2+/-小鼠和Runx2+/+小鼠的牙周創(chuàng)傷和股骨創(chuàng)傷的愈合情況；用基因激活基質(zhì)(gene-activated matrix，GAM)將Runx2表達載體pCMV-Osf2/Cbfa1引入7周大的Runx2+/+(野生小鼠)的牙周創(chuàng)區(qū)，并用H&E染色，免疫組化染色，組織學測量和半定量RT-PCR評價Runx2過表達對小鼠牙周創(chuàng)傷愈

7、合的作用。 結果： 第一部分：體外培養(yǎng)的牙囊細胞經(jīng)過多次傳代后，細胞密度增高，細胞的大小和形態(tài)接近一致。牙囊細胞和骨髓基質(zhì)細胞經(jīng)骨相誘導培養(yǎng)基誘導4周并經(jīng)茜素紅染色后可見致密紅染的細胞外基質(zhì)沉積，牙囊細胞和骨髓基質(zhì)細胞形成的礦化結節(jié)形態(tài)并無明顯差別，但牙囊細胞形成的礦化結節(jié)數(shù)量較少，牙囊細胞培養(yǎng)物內(nèi)的茜素紅沉積量也顯著低于骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)物。經(jīng)脂肪細胞分化誘導后，牙囊細胞和骨髓基質(zhì)細胞的形態(tài)未發(fā)生明顯變化。油紅O(Oil

8、 Red O)染色后兩組細胞均可見到陽性染色的脂肪滴形成，但是牙囊細胞培養(yǎng)物中的脂肪滴形成少于骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)物，提示前者的成脂肪細胞能力弱于后者。半定量RT-PCR結果顯示，牙囊細胞中脂蛋白酯酶(LPL)的表達量顯著低于骨髓基質(zhì)細胞中LPL的表達量。經(jīng)軟骨細胞分化誘導和阿利新蘭染色(Alcian blue)后牙囊細胞和骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)物內(nèi)均可見類軟骨樣嗜阿利新蘭染色的基質(zhì)，但牙囊細胞中阿利新蘭染色的強度弱于骨髓基質(zhì)細胞。用半定量RT-

9、PCR檢測小鼠α1(Ⅱ)procollagen表達水平的結果顯示，牙囊細胞中α1(Ⅱ)procollagen的表達水平顯著低于骨髓基質(zhì)細胞。第二部分：Satb2在切牙牙胚的間充質(zhì)成分中高水平表達，但在上皮成分中不表達。同時，Satb2在發(fā)育中的顎骨和下頜骨基質(zhì)中也高水平表達，但在Meckel’s軟骨中不表達。在發(fā)育中的正在向中線生長的腭突邊緣，Satb2的表達尤其強烈。過表達Satb2的骨髓基質(zhì)細胞中，BSP，Runx2，Osx和VEG

10、FA的表達均增強。BMP4可以誘導Satb2的表達，而且BMP4誘導的骨特異性基因和VEGF的表達模式與Satb2誘導的表達模式不同。Satb2在處于牙根發(fā)育階段的正常小鼠磨牙牙囊細胞中也有表達，而且Satb2在牙囊細胞中的過表達也增強了BSP和Runx2的表達。過表達Satb2的MC3T3細胞中BSP，Osx，Runx2和VEGF的表達均增強。同時，Satb2過表達MC3T3細胞的遷移速率被輕度提高。Satb2在HEK-293細胞和M

11、C3T3-E1細胞中過表達分別將Osx的啟動子活性增強了1.6和1.8倍，而Runx2在HEK-293細胞和MC3T3-E1細胞中過表達將Osx啟動子活性分別增強了1.8和2.52倍。另外，Satb2可將Runx2的激活效應增強2倍。H&E染色，免疫組化染色和組織學測量結果顯示Satb2在牙囊細胞和骨髓基質(zhì)細胞中過表達促進了成骨細胞分化和牙周手術創(chuàng)傷的愈合。 第三部分：H&E染色，免疫組化染色和組織學測量結果表明Runx2基因單

12、倍劑量不足導致小鼠牙周及股骨創(chuàng)區(qū)愈合不良，而在野生小鼠牙周創(chuàng)區(qū)局部釋放Runx2質(zhì)粒促進了牙周創(chuàng)區(qū)的愈合。組織學測量表明術后7天對照組和實驗組創(chuàng)傷側(cè)的牙周膜寬度比較非創(chuàng)傷側(cè)均有輕度增寬，但術后14天實驗組創(chuàng)傷側(cè)的牙周膜寬度降低，與非創(chuàng)傷側(cè)的牙周膜寬度相比，差別沒有統(tǒng)計學意義。RT-PCR和免疫組化染色結果也顯示在牙周創(chuàng)區(qū)內(nèi)應用GAM技術導入Runx2表達載體可在術后7天顯著增強Runx2在牙周創(chuàng)區(qū)內(nèi)的表達，而在術后14天仍能維持一個較高

13、水平的Runx2表達，同時BSP的表達也得到增強。 結論： 在本研究中，我們用體外誘導的方法成功誘導了牙囊細胞向成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞的分化，進一步證實了牙囊細胞中具有多向分化潛能的干細胞的存在。研究表明，雖然牙囊細胞可以在體外經(jīng)誘導分化成成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞，但牙囊細胞培養(yǎng)物的特殊染色強度均低于骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)物，提示牙囊細胞的多向分化潛力弱于骨髓基質(zhì)細胞，或同樣的細胞總數(shù)內(nèi)牙囊細胞中干細胞的比例小于骨髓

14、基質(zhì)細胞中干細胞的比例。Satb2在顎骨和頜骨基質(zhì)中的高水平表達證實了Satb2在成骨細胞分化和骨形成過程中的重要作用，而satb2在腭突邊緣的高水平表達也與病案報道和動物研究中Satb2與腭裂相關的結論相一致。Satb2牙胚中的表達模式提示Satb2在牙齒間充質(zhì)組分如牙本質(zhì)，牙髓和牙周組織的發(fā)育過程中也起一定的作用。Satb2在骨髓基質(zhì)細胞、牙囊細胞以及小鼠成骨細胞系MC3T3中過表達增強了骨基質(zhì)蛋白BSP的表達水平，同時也增強了促進

15、成骨的轉(zhuǎn)錄因子Runx2和osterix的表達水平。而且，Satb2不僅可以直接促進osterix的表達，而且還可以通過與Runx2的協(xié)同作用增強Runx2促進osterix表達的作用。Satb2還增強了血管內(nèi)皮生長因子VEGFA的表達水平，提示Satb2在組織修復過程中可能還具有促進血管生成的能力。細胞遷移試驗結果提示創(chuàng)傷修復過程中，Satb2可能通過促進成骨細胞前體細胞向創(chuàng)區(qū)遷移而不斷補充衰老和凋亡的成骨細胞和骨細胞，從而達到促進創(chuàng)

16、傷愈合的目的。另外，Satb2基因功能缺陷導致的腭裂也可能與Satb2促進細胞遷移的能力受到影響有關。通過體內(nèi)實驗和牙周創(chuàng)傷模型，我們證實了Satb2在種子細胞(牙囊細胞和骨髓基質(zhì)細胞)中過度表達促進了牙周創(chuàng)傷的愈合速度，并增強了干細胞向成骨細胞分化的能力。然而，植入牙囊細胞和植入骨髓基質(zhì)細胞對牙周創(chuàng)傷愈合的促進能力并沒有明顯的差別。Runx2+/-小鼠中由于Runx2基因的單倍劑量不足造成骨創(chuàng)傷的愈合的延緩，提示Runx2在骨及牙周創(chuàng)