丙戊酸誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞自噬及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 前列腺癌是美國最常見的腫瘤，在癌癥引起的死亡中位居第二位。在前列腺癌的發(fā)病率一直較低的國家如中國，其發(fā)病率也呈快速上升趨勢。該病一旦診斷，其主要的治療方法為手術(shù)切除和放射治療，但這兩種方法對于晚期前列腺癌的治療效果均不佳，因此其長期生存率也是很低的。近年來，越來越多的文獻報道，組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylase inhibitor,HDACI)可在體內(nèi)外抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)分化和

2、凋亡。丙戊酸(Valproic acid，VPA)作為HDACI類藥物，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長抑制、分化和凋亡，但關(guān)于VPA誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡的文獻報道較少，在本項研究中，我們擬就VPA誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞系發(fā)生自噬性死亡的過程進行觀察，并對其作用機制進行初步探討，為臨床開發(fā)治療前列腺癌的新藥物提供理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 對VPA誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡的過程在體外進行觀察和

3、檢測，并初步探索自噬與Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，為深入研究VPA抑制前列腺癌細(xì)胞生長的作用機制提供進一步理論依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 將人前列腺癌PC-3細(xì)胞接種于96孔板中，5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，應(yīng)用5.0mmol/L VPA進行干預(yù)，并設(shè)立對照組，作用24h、48h、96h后行CCK-8染色法檢測細(xì)胞生長情況。本實驗分為對照組和VPA5.0mmol/L組。于細(xì)胞對數(shù)生長期加入藥物VPA，分別培

4、養(yǎng)24h、48h及72h，收集制備標(biāo)本后行透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(包括自噬體和自噬溶酶體)。PC-3細(xì)胞接種于蓋玻片置于6孔板中，分組及培養(yǎng)時間同上，常規(guī)收集、固定細(xì)胞，加入一抗及帶FITC熒光標(biāo)記的二抗制片，應(yīng)用免疫熒光測定儀觀察細(xì)胞內(nèi)熒光的數(shù)量及強度。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，分組及藥物作用濃度和時間同上，應(yīng)用Western-blotting檢測經(jīng)VPA處理后PC-3細(xì)胞內(nèi)LC3-11、p-Akt蛋白的表達水平。
　　 結(jié)果：<

5、br>　　 經(jīng)VPA處理后，人前列腺癌PC-3細(xì)胞系細(xì)胞增殖活性實驗組與對照組短期內(nèi)差別不大，無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。透射電子顯微鏡觀察可見人前列腺癌PC-3細(xì)胞系細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量自噬體和自噬溶酶體，實驗組自噬體的數(shù)量較對照組明顯增多，且隨VPA作用時間的延長自噬的水平逐漸增強，證明了VPA誘導(dǎo)人前列腺癌PC-3細(xì)胞自噬性死亡的存在。經(jīng)綠色熒光FITC標(biāo)記的自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ可以清楚顯示自噬在細(xì)胞中的分布，即可見LC3綠

6、色熒光呈點狀散在分布于細(xì)胞膜附近，而陰性對照組只有極弱的熒光。隨VPA作用時間的延長，人前列腺癌PC-3細(xì)胞系細(xì)胞自噬特異性相關(guān)蛋白LC3-11表達水平明顯升高，而p-Akt蛋白的表達水平則明顯降低，變化趨勢顯著，有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 VPA作用人前列腺癌PC-3細(xì)胞4天，可誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞發(fā)生自噬，其自噬的程度與藥物作用的時間呈正相關(guān)，其誘導(dǎo)列腺癌PC-3細(xì)胞發(fā)生自噬的機制與阻