細胞色素P450 BM-3定向進化研究.pdf

1、細胞色素P450 BM-3(CYP102)是一種具有脂肪酸羥基化活性的P450單加氧酶。野生型P450 BM-3酶能催化長鏈飽和脂肪酸ω-1、ω-2、ω-3位的羥基化和不飽和脂肪酸的雙鍵環(huán)氧化反應。經過蛋白質工程改造，其催化底物范圍拓展至中鏈脂肪酸、烷烴、環(huán)烷烴、雜烷烴、多環(huán)芳烴等，其中借助理性設計得到的P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)突變酶能催化吲哚羥基化反應。為了進一步探索該酶新的催化能力，論文以P450 BM-3

2、(A74G/F87V/L188Q/E435T)為親本，通過飽和突變及易錯PCR技術構建突變文庫，篩選得到了催化產物組成不同于父本的突變酶，并對突變酶的催化性質進行了較為系統(tǒng)的研究。 首先，基于已有P450 BM-3結構與功能關系的研究結果，選擇突變酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/E435T)的D168位點進行飽和突變。優(yōu)化了飽和突變反應條件，并構建得到由E. coli BL21收集的D168飽和突變文庫。

3、 其次，通過易錯PCR技術對細胞色素P450 BM-3的單加氧酶域進行了隨機突變。選擇了6個不同的Mn<'2+>濃度進行PCR反應，以含有葡萄糖脫氫酶(GDH)基因和P450 BM-3酶基因的pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310質粒為載體，得到了共表達P450 BM-3和葡萄糖脫氫酶的突變文庫。 利用96微孔板對突變文庫進行篩選并得到了兩個催化性質不同于親本的突變酶D168R與D168W。其中，突變酶D168

4、W催化吲哚羥基化反應所得產物組分發(fā)生了較大改變。經鑒定，突變酶D168W的催化主產物為靛玉紅，比例達90％。 第三，對分離純化所得突變酶D168R與D168W進行了酶學性質研究。其中在以10-對硝基苯氧基癸酸(10-pNCA)為底物的催化反應研究中發(fā)現，突變D168W削弱了酶對該類底物的羥基化能力。在突變酶催化吲哚羥基化反應動力學參數的測定過程中，對實驗方法進行了改進，利用Ultrospec3300 pro分光光度計全波長掃描功

5、能，實現了對反應過程的全波長動態(tài)實時監(jiān)測，從而直觀地反映出輔酶NADPH消耗與產物形成之間的聯系。通過該法可以幫助實驗者在進行酶催化反應動力學參數的同時完成有關電子耦合系數的測定，提高了實驗效率。 綜合分析實驗結果，D168R的位點突變不僅提高了酶對底物吲哚的親和力和催化效率，還可有效增強其催化吲哚羥基化反應的電子耦合效率；突變酶D168R在催化吲哚羥基化反應過程中能夠得到以靛玉紅為主的催化產物，但反應電子耦合效率有明顯下降。試