重組大腸桿菌KR-C生產(chǎn)酮基還原酶發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化.pdf

1、酮基還原酶（ketoreduetase，KR)是一種具有高度化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性的生物催化劑，在輔酶還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)的參與下，可以立體選擇性地還原4-氯乙酰乙酸乙酯(ethyl4-chloro-3-oxobutanoate, COBE)生成具有光學(xué)活性的高附加值的他汀類藥物中間體S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(S-4-c

2、hloro-3-hydroxybu-tanoate esters, S-CHBE)。目前的研究主要集中于酮基還原酶的基因改造、輔酶再生以及生物催化過(guò)程優(yōu)化，而對(duì)于酮基還原酶發(fā)酵調(diào)控方面的報(bào)道較少。
　　本論文以一株高積累KR的重組大腸桿菌（Escherichia coliKR-C）為出發(fā)菌株，以KR的高產(chǎn)量、高生產(chǎn)強(qiáng)度為目標(biāo)，通過(guò)對(duì)過(guò)程質(zhì)譜儀獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)挖掘，并結(jié)合微生物生理代謝相關(guān)原理以及多尺度相關(guān)分析原理進(jìn)行分析，

3、采用了針對(duì)發(fā)酵過(guò)程的外因定性優(yōu)化（基于微生物反應(yīng)原理的培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(shù)）、內(nèi)因定性優(yōu)化（基于代謝特性的分階段培養(yǎng)技術(shù)）等一系列技術(shù)對(duì)KR發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，初步得到了較優(yōu)的KR發(fā)酵工藝。研究的主要結(jié)果如下：
　?。?）對(duì)50L罐E.coli KR-C的發(fā)酵特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)初始發(fā)酵曲線符合大腸桿菌的基本生長(zhǎng)代謝規(guī)律，質(zhì)粒穩(wěn)定性維持在較高水平。采用流加氨芐的發(fā)酵工藝使得質(zhì)粒更加穩(wěn)定，但是兩種發(fā)酵條件下的KR活力都在12 h后開(kāi)始下降

4、，表明質(zhì)粒穩(wěn)定性并不是影響KR酶活在發(fā)酵后期下降的主要因素。
　?。?）分批培養(yǎng)結(jié)果表明溫度對(duì)E.coli KR-C生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響顯著。在27 oC~37 oC范圍內(nèi)，較高溫度不僅對(duì)細(xì)胞生物量有促進(jìn)作用，而且還對(duì)KR的酶活有提升作用。因此，采用37oC的溫度控制策略對(duì)于提高KR產(chǎn)量具有實(shí)際效果，但是所有溫度條件下的KR酶活仍在發(fā)酵后期開(kāi)始下降，表明溫度升高雖然有利于KR的酶活提升，但并不是影響發(fā)酵后期KR酶活表達(dá)的關(guān)鍵因素。

5、r>　?。?）溶氧對(duì)E.coli KR-C分批發(fā)酵的影響結(jié)果表明：在通氣量恒定的情況下，不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌體OD600和KR產(chǎn)量有較大影響。最高的轉(zhuǎn)速提供了充足的溶氧，更有利于菌體的生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶。相對(duì)于溶氧轉(zhuǎn)速聯(lián)動(dòng)控制策略，恒定的轉(zhuǎn)速條件下KR酶活在發(fā)酵后期不再下降，表明轉(zhuǎn)速的恒定對(duì)于發(fā)酵后期的菌體產(chǎn)酶具有重要意義。采用37oC、480r/min的發(fā)酵條件，KR酶活在發(fā)酵結(jié)束的20h達(dá)到了217.1 U/mL，相對(duì)于初始發(fā)酵條件下的KR

6、酶活（92.9 U/mL）提高了一倍以上，并且KR酶活的提升與菌體OD600的積累首次出現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。
　　（4）初始甘油的濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致乙酸的利用障礙，乙酸濃度的高居不下使得菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶受到很大的抑制，適當(dāng)?shù)母视蜐舛仁羌?xì)胞快速生長(zhǎng)和控制乙酸積累的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2％的初始甘油濃度恰好在乙酸濃度超過(guò)5g/L的閥值（明顯抑制菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的最低濃度）后下降，表明2%的初始甘油濃度剛好是E.coli KR-C發(fā)酵的最佳初始碳源濃度。<

7、br>　　（5）不同種類的有機(jī)氮源對(duì)E.coli KR-C的生長(zhǎng)有非常明顯的區(qū)別，酵母抽提物作為速效氮源對(duì)菌體初始生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，酵母蛋白胨可以使菌體生長(zhǎng)大致符合通常的發(fā)酵規(guī)律，但沒(méi)有明顯的二次生長(zhǎng)現(xiàn)象?？傊?，兩種有機(jī)氮源對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響各有不同，酵母抽提物與酵母蛋白胨以7:3的比例混合作為初始氮源成分，才能得到比較理想的發(fā)酵效果。
　?。?）實(shí)驗(yàn)研究了發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中乙酸大量積累（2 g/L以上）時(shí)期E.coli KR-C生長(zhǎng)保

8、護(hù)策略及KR的誘導(dǎo)策略。結(jié)果表明，將pH強(qiáng)制控制在7.0左右以上對(duì)菌體生長(zhǎng)沒(méi)有明顯促進(jìn)作用，反而會(huì)造成菌體代謝失衡而導(dǎo)致乙酸大量積累。添加甲硫氨酸來(lái)緩解乙酸抑制的效果也不明顯，可能原因是5g/L以下的乙酸濃度對(duì)E.coli KR-C的生長(zhǎng)抑制作用本來(lái)就不高。誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖的添加時(shí)機(jī)并不是越晚越好，越晚誘導(dǎo)，KR在菌體內(nèi)的積累時(shí)間越短，發(fā)酵前期加入誘導(dǎo)劑雖然會(huì)在一定程度上對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生代謝負(fù)荷，但早期誘導(dǎo)會(huì)更有利于降低菌體過(guò)高的比生長(zhǎng)

9、速率，避免乙酸的過(guò)度積累。因此，誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖選擇在2h添加，考慮到工藝的成本，批發(fā)酵中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和pH控制策略將不作改變。
　?。?）實(shí)驗(yàn)考察了E.coli KR-C補(bǔ)料分批發(fā)酵中碳氮源的補(bǔ)加策略。結(jié)果表明，發(fā)酵液中的氨基氮含量要維持在一定范圍內(nèi)，過(guò)低的氨基氮濃度會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，過(guò)高氨基氮濃度則會(huì)加速菌體生長(zhǎng)抑制產(chǎn)酶。采用pH-stat補(bǔ)料發(fā)酵法生產(chǎn)KR時(shí)，將氨基氮含量設(shè)置為不低于1.6 g/L，不高于1.8 g/L