飼料中氨基酸的測(cè)定

1、飼料中氨基酸的測(cè)定,黎觀紅江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,6 飼料中氨基酸的測(cè)定(教材P106),氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物；蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)——氨基酸營(yíng)養(yǎng)（不是很確切，小肽營(yíng)養(yǎng)）；理想蛋白或理想氨基酸模式（畜禽日糧的氨基酸平衡理論） ——飼料蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定。,6.1 概述,6 飼料中氨基酸的測(cè)定,氨基酸的分析測(cè)定,飼料級(jí)氨基酸添加劑（單體制劑含量或純度測(cè)定）,簡(jiǎn)單的化學(xué)分析,6 飼料中氨

2、基酸的測(cè)定,6.2 氨基酸飼料添加劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢驗(yàn),飼料中氨基酸的測(cè)定(教材P120-131),6.3 氨基酸自動(dòng)分析儀法（離子交換層析法） 氨基酸自動(dòng)分析儀：主要由日本（Hitachi日立系列產(chǎn)品）、美國(guó)（貝克曼（Beckman）公司）、英國(guó)（安瑪西亞公司）、德國(guó)（安米諾西斯公司）等國(guó)家生產(chǎn)。 氨基酸測(cè)定專用儀器，準(zhǔn)確度高，設(shè)備昂貴。,日立L－8800氨基酸自動(dòng)分析儀,L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀的內(nèi)部結(jié)構(gòu),飼料中

3、氨基酸的測(cè)定,6.3 氨基酸自動(dòng)分析儀法（離子交換樹(shù)脂法）（一）測(cè)定原理,,飼料中氨基酸的測(cè)定,6.3 氨基酸自動(dòng)分析儀法（離子交換樹(shù)脂法）（一）測(cè)定原理 氨基酸的分離（離子交換樹(shù)脂分離）： A、離子交換層析（ Ion Exchange Chromatography ）基本原理 以離子交換劑為固定相，特定的離子溶液為流動(dòng)相，依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同進(jìn)行分離純化的層析方式。,飼料中氨基

4、酸的測(cè)定,A、離子交換層析基本原理,離子交換劑由基質(zhì)、電荷基團(tuán)（或稱功能基團(tuán)）和 反離子組成?；|(zhì)一般是不溶性聚合物，如樹(shù)脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等；,纖維素－O — CH2— COO-— Na＋ 基質(zhì) 電荷基團(tuán) 反離子,樹(shù)脂 － N+(CH3) — OH-,RA+B＋ RB＋A+(RA是陽(yáng)離子交換劑，B為溶液中的離子或

5、待分離的生物分子）,A、離子交換層析基本原理,當(dāng)[A+]=[B+],[RB]>[RA], 說(shuō)明 R－ 與B＋的結(jié) 合力比A＋大；反之亦然。 對(duì)于兩性蛋白而言，結(jié)合力取決于其等電點(diǎn)以及 溶液的pH值。,飼料中氨基酸的測(cè)定,,1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合。2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換。3、4. 解吸附階段：用梯度緩沖液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)。5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，即

6、可重復(fù)使用。,飼料中氨基酸的測(cè)定,A、離子交換層析基本原理,Ion-exchange chromatography,（一）測(cè)定原理B、氨基酸的分離（離子交換樹(shù)脂分離）氨基酸：兩性電解質(zhì)，不同氨基酸電離常數(shù)各不相同。pH、pI,氨基酸的pI從2.77（天門(mén)冬氨酸）到10.76（精氨酸）不等。大多在5～6之間。谷氨酸：3.22；組氨酸：7.59；賴氨酸：9.74。氨基酸的等電點(diǎn)不同氨基酸對(duì)樹(shù)脂的親和力不同，其強(qiáng)弱順序?yàn)椋簤A性氨基酸&g

7、t;芳香族氨基酸>中性氨基酸>酸性氨基酸及羥基氨基酸。,6.3 氨基酸自動(dòng)分析儀法（離子交換樹(shù)脂法）,陰離子 兩性離子 陽(yáng)離子 （pH>pI） （pH=pI） （pH<pI）,氨基酸pH2.2 的條件下都帶正電荷，在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上均 在被吸附，但結(jié)合強(qiáng)度各不相同。隨著緩沖液在離子交

8、換柱上流動(dòng)，氨基酸不斷地吸附、解吸附，由于氨基酸性質(zhì)的差異（酸堿性、極性、分子大小） 吸附強(qiáng)度有差異。不同氨基酸與離子交換樹(shù)脂的親和力不同： 堿性氨基酸 > 芳香族氨基酸>中性氨基酸>酸性氨基酸及羥基氨基酸。提高流動(dòng)相pH值，氨基酸正電荷減少，吸附力減弱，最后從離子交換柱上洗脫下來(lái)。 洗脫順序是酸性和帶羥基氨基酸、中性氨基酸、堿性氨基酸。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液中各種氨基酸在氨基酸自動(dòng)分析儀上被洗脫的順 序一定，標(biāo)準(zhǔn)液

9、各種氨基酸的濃度一定，洗脫峰的面積一定，由此可計(jì)算出樣品中各種氨基酸的含量。,（一）測(cè)定原理B、氨基酸的洗脫,飼料中氨基酸的測(cè)定,6.3 氨基酸自動(dòng)分析儀法（離子交換樹(shù)脂法）（一）測(cè)定原理B、氨基酸的洗脫,用pH遞增的檸檬酸鹽緩沖溶液洗脫側(cè)鏈pKa增大的氨基酸,分離后的氨基酸與茚三酮試劑在高溫反應(yīng)器中進(jìn)行衍生反應(yīng)，生成可以被分光光度計(jì)檢測(cè)的有色物質(zhì)，然后在檢測(cè)器中被檢測(cè)出來(lái)。,C、氨基酸與茚三酮反應(yīng),茚三酮反應(yīng),飼料中氨基酸的測(cè)定

10、,6.3 氨基酸自動(dòng)分析儀法（離子交換樹(shù)脂法）（一）蛋白質(zhì)的水解A、鹽酸水解（常規(guī)或直接水解法） 適用范圍：飼料原料、配合飼料、濃縮飼料中除色氨酸、含硫氨基酸以外的15種氨基酸的準(zhǔn)確測(cè)定。（為什么是15種？） 樣品加入6 mol/L的HCl溶液，真空封口，在110℃下水解22～24 h，冷卻后定容、過(guò)濾、蒸干。上機(jī)測(cè)定。,此過(guò)程中，色氨酸全部被破壞，含硫氨基酸被部分氧化損失，大約損失20～30％。加入巰基乙醇可部分保

11、護(hù)蛋氨酸，提高測(cè)值10％～20％,,天冬酰胺,谷氨酰胺,飼料中氨基酸的測(cè)定,6.3 氨基酸自動(dòng)分析儀法（離子交換樹(shù)脂法）（一）蛋白質(zhì)的水解B、氧化－酸水解 氧化水解法是將飼料蛋白中的含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等)用過(guò)甲酸氧化，然后進(jìn)行酸解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，再經(jīng)離子交換色譜分離、測(cè)定。 本方法主要適用于含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）的準(zhǔn)確分析測(cè)定。此方法還可以測(cè)定芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）及組氨酸

12、以外的氨基酸。水解中色氨酸破壞，不能測(cè)定。酪氨酸在以偏重亞硫酸鈉做氧化終止劑時(shí)，被氧化，不能測(cè)準(zhǔn)。酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸則在以氫溴酸作終止劑時(shí)被氧化，不能測(cè)準(zhǔn)。,飼料中氨基酸的測(cè)定,6.3 氨基酸自動(dòng)分析儀法（離子交換樹(shù)脂法）（一）蛋白質(zhì)的水解 C、堿水解 本方法適用于飼料原料、配合飼料和濃縮飼料中色氨酸的測(cè)定。 飼料蛋白在110℃，堿的作用下水解，水解出的色氨酸可用離子交換色譜或高效反相色譜分離、

13、測(cè)定。另： 分光光度法測(cè)定飼料中的色氨酸：飼料中蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后，降解成多肽和游離的氨基酸，在酸性介質(zhì)中，氧化劑存在下，色氨酸吲哚環(huán)與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在一定范圍內(nèi)顏色深淺與色氨酸含量成正比。,飼料中氨基酸的測(cè)定,6.3 氨基酸自動(dòng)分析儀法（離子交換樹(shù)脂法）（一）蛋白質(zhì)的水解 D、酸提取法酸提取法適于配合飼料、預(yù)混料和濃縮飼料中添加氨基酸，主要是賴氨酸、蛋氨酸含量的測(cè)定，也可用于蘇氨酸、色氨酸等其他