結核病快速診斷進展

1、結核病快速診斷進展,內(nèi)容,結核病實驗室工作在結核病控制中的作用為什么要進行EQAEQA 培訓的重要意義4. 結核病實驗室相關的流行病學理論5. 痰涂片鏡檢的操作原理6. 全球結核病快速診斷進展,結核病實驗室工作在結核病控制中的作用,診斷 （發(fā)現(xiàn)傳染源）治療 （確定治療方案）療效評價結核病控制策略和措施的評估,Diagnosis of Pulmonary TB Relatedto Numbers of Tu

2、bercle Bacilli,,,,10,102,103,104,105,106,,,,,,,,Poor microscopy (25%),Good microscopy (55%),Culture / PCR (25%),X-ray/clinical only (20%),← AFB per ml of sputum,,Slide Courtesy: Van Deun A, Nov 2003,細菌 – 讓人們聯(lián)想到什么?,疾病傳染性

3、流行性食物腐敗在目前已知的細菌中有1%的細菌可以導致人患病在目前已知的細菌中有4%的細菌可以導致植物得病 95%已知細菌不具有致病性,為什么要進行EQA,增加人員的責任心推行標準化、規(guī)范化操作確保實驗室服務質量的提高生物安全的需要加強實驗室網(wǎng)絡、采集信息,痰涂片鏡檢EQA 培訓的意義,強化EQA的理解，有利于積極推廣提高實驗室服務質量提高對結核病實驗室工作的重視逐步提高結核病防治人員特別是結核病實驗室工作人員

4、的地位,結核病實驗室相關的流行病學理論,結核病的發(fā)病學和流行冰山理論水庫理論病因分析和療效評價,核分枝桿菌在人體中的生活周期,,,,,,,,,,,,,,感染,感染 – 95%,后期表現(xiàn) - 5%,,,病變早期進展 - 5%,,例如： HIV, 嬰幼兒,例如：移民,結核分枝桿菌的生活周期,,,,,,,,,,,,,感染,人體內(nèi)生存,由肺中排入空氣中,,,進入細胞內(nèi)侵犯人體免疫防御系統(tǒng),免疫激活和營養(yǎng)限制,免疫病理,釋放調(diào)控因子, 例

5、如 sigma factors,釋放抗原性蛋白,改變營養(yǎng)需要,改變細胞壁,,,,微生物和人類,,Very few microbes are,always pathogenic,Many microbes are,potentially pathogenic,Most microbes are,never pathogenic,,,,,potential pathogen isolated from or detected in clin

6、ical samples,,,,,,,,,Recognised syndromes,patient's clinical condition,e.g.,septicaemia, endocarditis,,osteomyelitis meningitis,,UTI, pneumonia,pharyngitis,,我們?nèi)绾沃捞囟ǖ牟≡⑸镏虏?,診斷和有效的治療不僅依靠分離病原微生物，而且在于建立實驗室和病人臨床癥狀的聯(lián)系,,

7、,如何推測特定病原體可以致病?,Koch‘s 推測病原體必須在每一例病例中都出現(xiàn)病原體可以從宿主中分離并且可以在純培養(yǎng)基中生長當特定的病原體接種到健康機體時特定的疾病會發(fā)生病原微生物可以在實驗動物中恢復,,,Spectrum of virulence,poliomyelitis in a child,0.1-1% of infections are,clinically apparent,,,,rubella,50% of in

8、fections are,clinically apparent,rabies,100% of infections,are clinically apparent,,,,,,,,,,,,,,傳染性疾病的冰山理論,asymptomatic infection,classical,clinical disease,less severe,disease,水庫理論,,,,,發(fā)病人數(shù),死亡人數(shù),治愈人數(shù),現(xiàn)有病人數(shù),痰涂片鏡檢的操作原理,分枝

9、桿菌的發(fā)現(xiàn)歷史,1590 年荷蘭楊森父子發(fā)明了顯微鏡19世紀末,顯微鏡技術、染色技術已應用于微生物檢測,分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)條件已成熟在發(fā)現(xiàn)結核菌前,科霍已是一位在微生物學方面取得豐碩成果的學者.,Robert Koch – 第一個證明細菌可以致病,1876傳染病的微生物病因學病因學 - 疾病的病因建立 “科學規(guī)則” 來確定微生物和疾病的病因和效應關系Koch’s 原理,Koch確定了3個重要疾病的病因,1. 霍亂 (fec

10、al-oral disease)Vibrio cholerae2. 結核病 (pulmonary infection)Mycobacterium tuberculosis3. 炭疽(sheep and cattle)Bacillus anthracis,結核病,Figure 24.9,結核分枝桿菌：棒狀抗酸菌. 可以在人與人之間傳播牛型結核桿菌: 美國的病例數(shù)〈１％,不在人與人之間傳播鳥胞內(nèi)分枝桿菌，可以感染 AIDS

11、晚期患者,光學顯微鏡的基本原理,為區(qū)分物體不同的兩點,這兩點的光學成像必須落在視網(wǎng)膜上不同的感光細胞上;顯微鏡下,光線經(jīng)過顯微鏡物鏡折射成倒立放大的實像,然后經(jīng)目鏡折射成正立放大的虛像;經(jīng)顯微鏡放大后,人眼就可以區(qū)分物體不同的兩點,以達到觀察微小物體的目的;由于光線衍射的原因,普通光學顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體；,分辨率和對比度,人的肉眼不能看清小于0.1毫米的物體普通光學顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體電

12、子顯微鏡不能看清小于0.1納米的物體,電子顯微鏡下的結核分枝桿菌,生理條件下細菌的表面往往帶有大量負電荷,原因：細菌表面帶有正負電荷的基團，等電點多在PH７以下，因此在中性或堿性條件下細菌的表面往往帶有大量負電荷,染色反應,Stains - salts composed of a positive and negative ion, one of which is colored (chromophore)堿性染料 – 著色基團帶正

13、電荷dye+ Cl-酸性染料 – 著色基團帶正電荷Na+ dye-,分枝桿菌涂片鏡檢基本原理,１、待檢標本中存在分枝桿菌，即受檢者排菌２、分枝桿菌的特殊結構決定了染色方法：　　　染色劑 細菌表面帶負電荷,與堿性復紅易于結合,　　　　加熱 加深分枝桿菌著色程度　　　　脫色 為了易于鏡檢，應該使抗酸菌以外的所有物質近乎完全脫色　　　　復染 提供一個良好的對比，隱去背景中殘留的紅色，但

14、不掩蓋抗酸菌。而且，復染既要使涂片的背景易于鏡檢時調(diào)焦，同時又不能太深以至分散太多注意力,結核菌感染及排出示意圖,結核病,結核病,細胞壁,革蘭氏陽性菌,革蘭氏陰性菌,分枝桿菌,脂質雙分子,肽聚糖,MYCOLATE,lipid + LPS,porins,acyl lipids,arabinogalacta,LAM,細胞膜,兩種主要結構成分雙層磷脂　double layer of phospholipids蛋白質　　proteins,1

15、. 痰涂片操作程序原理2. 二甲苯問題,假陰性 假陽性技術錯誤 涂片: 太薄/太厚、暴露在紫外線下 標本中的混雜物質 / 加熱時間過長

16、 / 使用污染的木簽 染色: 染色質量不佳、未熱染、染色時 結晶/環(huán)境抗酸菌、 間太短、脫落、涂片未固定 交叉污染 脫色: 脫色不佳 脫色不佳 復染: 過染

17、 染色不佳鏡檢員 視力缺陷、僅觀察少數(shù)視野、 經(jīng)鏡油交叉污染讀片錯誤： 未經(jīng)培訓 未經(jīng)培訓記錄/報告： 記錄錯誤 記錄錯誤,產(chǎn)生錯誤結果的常見原因,,,,,,,,細菌感

18、染的診斷,,病人,臨床診斷,血液生化,Non-microbiological investigations,影像學,,,,,,標本,分泌物 標本,,實驗室檢查是臨床診斷的必要環(huán)節(jié),OUTLINE,細菌學診斷 顯微鏡檢查術 培養(yǎng)免疫學診斷分子生物學診斷 Gen Probe 噬

19、菌體檢測方法 HPLC 其他,結核分枝桿菌的細菌學診斷,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,培養(yǎng),,,,,,,,,,on

20、 plates or in broth,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,顯微鏡檢查,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,脫色,,,,,復染,,,,,,染色

21、,unstained or stained with e.g. Gram stain,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,藥敏,,,,,,,,,,血清學,DNA 方法,by disc diffusion methods, breakpoints or MICs,,,,顯微鏡檢查,Gram-染色抗酸染色Ziehl-Neelsen熒光染色Direct, e.g. auramineImmunofluorescenc

22、e,培養(yǎng),Solid mediaAgar platesFor IdentificationFor EnumerationSlopesFor safe long-term culture, e.g. Lowenstein-Jensen media for TBLiquid media (broth)For enrichment or maximum sensitivity,菌種鑒定,形態(tài)學生長條件生化反應酶抗原分子

23、生物學方法,非培養(yǎng)的診斷方法,血清學檢測分子生物學方法其他（HPLC）,什么是分子生物學診斷方法 ?為什么用分子生物學診斷方法 ?可得的分子生物學方法?,,42,討論的議題,分子生物學方法是傳統(tǒng)方法的必要補充,顯微鏡檢查有假陽性 - T.vaginalis, N.gonorrhoeae胞內(nèi)致病菌 – viruses, M.genitalium 低敏感性 – Ch

24、lamydia sp.,Neisseria sp.慢速生長 – M. tuberculosis,分子生物學方法 – 如何發(fā)揮作用?,每個微生物擁有一些種屬特異的DNA序列分子生物學方法使得種屬特異性DNA可以衡量法醫(yī)鑒定,分子生物學方法是一系列DNA初級結構的方法,雜交的互補序列方法,擴增合成種屬特異的DNA序列,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,- T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C-,,-A-A

25、-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,PCR 實驗室,,,,,,,,,標本處理DNA 準備,潔凈屋儲存溶液,混合點,熱循環(huán)和擴增,檢測,,QC & QA質量控制 和質量保證,,R & D,,,,,Alternatives:

26、 - commercial kits - robots + kits,No alternative,①Bactec放射呼吸測定 以含有放射標記的軟脂酸為底物的液體培養(yǎng)基，自動測量分枝桿菌代謝14C軟脂酸脫致過程中釋放的14CO2的量。該法藥敏報告可縮短為4一12天。 ②分枝桿菌生長指示管法 Bactec放射呼吸測定法的替代方法。以培養(yǎng)基中加入熒光釕復合物代替放射性標記，其熒光衰減與細菌代謝過程中O2的消耗量有關。熒光衰

27、減可通過一系列不同的紫外透照管檢測。,Bactec呼吸測定,流式細胞儀測定法,原理: 分枝桿菌細胞內(nèi)的非特異性脂酶能水解培養(yǎng)基中加入的熒光素復合物(FDA)為游離的熒光素，因而分枝桿菌在生長過程中可造成熒光素的堆積，經(jīng)FCM即可檢測到。,比色法,①MTT法 MTT法為線粒體琥珀酸脫氫酶的作用底物，可被活細胞還原形成不溶性的Formazan產(chǎn)物,其生成量與活細胞數(shù)量成正相關。Formazan經(jīng)溶解后，可在酶標儀上測定其光吸收值。

28、②微孔板美蘭比色法 美蘭為耗氧指示劑，有氧時為藍色，無氧時為粉紅色。Franzblau等以美蘭為指示劑在96孔微量板中培養(yǎng)細菌，培養(yǎng)基中加入抗結核藥物，微量板用Parafilm封口膜封閉。若細菌為藥物敏感株，可被加入的抗結核藥物抑制或殺死，首先表現(xiàn)為氧消耗停止。而耗氧指示劑在各獨立微小隔氧環(huán)境中的頗色變化可客觀反映氧被消耗的程度，從而反映細菌的生長狀態(tài)。,噬菌體生物擴增法 將分枝桿菌噬菌體感染結核分枝桿菌，未進入菌體內(nèi)的噬菌體用特

29、異的杭噬菌體物質滅活，進入菌體內(nèi)的噬菌體得到保護而復制增殖，溶菌后釋放子代噬菌體，將此噬菌體與快速生長的恥垢分枝桿菌混合，接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察蝕斑的產(chǎn)生。蝕斑的數(shù)量與噬菌體數(shù)量有關，也與在含抗結核藥物培養(yǎng)基上存活的結核分枝桿菌數(shù)有關。,噬菌體法（Fast flaque),噬菌體熒光素酶檢測法 Jacobs等將熒火蟲熒光素酶基因導入分枝桿菌噬菌體，這種噬菌體感染分枝桿菌后，熒光素酶基因被代謝活躍的分枝桿菌活化，在菌細胞內(nèi)ATP存

30、在的條件下，可產(chǎn)生光子，通過熒光檢測器測定發(fā)光信號。只有耐藥的分枝桿菌才能在含藥的培養(yǎng)墓上生長，產(chǎn)生光子，敏感菌和死亡菌不產(chǎn)生或產(chǎn)生后不能維持。,噬菌體生物擴增法原理示意圖,Gen Probe 方法檢測結核分枝桿菌,1.原理2.菌種鑒定,RNA/RNA錯配法 Nash等(1997)首先將該法用于RFP耐藥菌株培養(yǎng)物的檢測。該法是基于雙鏈RNA能抵杭RNA酶的消化的原理而建立的。將待檢菌株以及藥物敏感的參考菌株(H37Rv)的PCR產(chǎn)物

31、混合，加入T7RNA多聚酶和SP6RNA多聚酶，通過轉錄形成兩條RNA，在進行雜交，若待檢測株為敏感株，則形成兩條互補的RNA，能抵抗RNA酶的消化，若待檢測菌株有突變發(fā)生，則不能與參考株RNA鏈完全配對，加入RNA酶后，雜交產(chǎn)物將在突變位點被切開，通過電泳即可檢測到。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Russia,Brazil,Tokyo,Sweden,Birkhaug,Danish,Prague,Glaxo,Tice,Frapp

32、ier,Connaught,Phipps,Pasteur,分枝菌酸(HPLC),Alpha,Methoxy,Keto,,,,300 bp,,200 bp,,100 bp,,Behr et al. J Bacteriol, 2000,DNA 測序法,Hirano等應用DNA測序法 DNA測序法被認為是檢測變異的“金標準”，可檢測出待檢基因上的所有突變位置和突變情況。利用PCR法擴增待檢基因，PCR產(chǎn)物可直接測序，24一48h即可提供精確序

33、列，并準確判定堿基突變的位點，已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐藥基因的檢測。,基因芯片,基因芯片 將耐藥基因的DNA或寡核苷酸序列標記到芯片上，從而快速的檢測出突變位點，可以在3個小時內(nèi)完成。,基因組學的問題,多樣性 單核苷酸多態(tài)性,復制子,缺失,重排株水平差異和種屬特異性基因的作用是什么?基因的功能通常是未知的主要是根據(jù)同類中的功能來推論翻譯成效應分子信息如何引導診斷、預防、治療疾病,M. tubercu

34、losis H37Rv,440萬堿基對 3924 預測基因 65.6 % GC 含量,Cole ST et al. Nature 1998; 393: 537.,斑點雜交和反相斑點雜交,,斑點雜交,,,DNA / RNA 標本,標記探針,,,反相斑點雜交,,,探針,標記DNA / RNA 標本,制作DNA芯片,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

35、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,96-孔板,,,,,,,,,,,,,‘printer’,玻片,,,,18mm,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA在玻片上的點樣,,,DNA 微陣列 - M. tuberculosis H37Rv的基因組芯片,3924 開放閱讀框一個基因一個探針,DNA微陣列,,,,,Cy3,Cy5,DNA /RNA,DN

36、A /RNA,,,,,,,,,,,,,,,,DNA 微陣列,,,掃描,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,cDNA 微陣列,Cy3 和 Cy5 熒光強度相等

37、,,,,Cy3 熒光信號強,Cy5 熒光信號強,,,,,Rv562,Rv2875,Rv780,Rv1974,Rv1976,Rv1978,M. tuberculosis vs. BCG-Danish 1331,H37Rv,BCG,Both strains,Behr MA et al. Science 1999; 284:1520.,Affymetrix 基因芯片,ACGT,ACGT,Genomic Sequence,‘C’