小鼠胚胎干細胞體外誘導(dǎo)分化為肝細胞及細胞移植對肝損傷作用的研究.pdf

1、肝臟是動物體內(nèi)最大的腺體,也是最重要的器官之一,肝臟的功能極為復(fù)雜,有體內(nèi)“化學(xué)工廠”之稱,所以肝臟一旦發(fā)病就嚴(yán)重威脅人類的身體健康,也是人類因疾病死亡的主要原因之一。目前人們對于各種原因?qū)е陆K末期肝病仍然沒有有效的治療措施,原位肝移植(orthotopic livet transplantation,OLT)成為了疾病治療最后的保障,然而由于肝臟供體來源的短缺和可能發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的限制,肝移植的應(yīng)用比較局限。肝細胞移植技術(shù)(hepa

2、toeyte transplantation,HCT)是繼原位肝移植技術(shù)后又一種治療各種終末期危重肝病的方法,而且相對于OLT更具有優(yōu)勢,但同樣也面臨著細胞來源的問題,而目前作為體外支持治療用的生物人工肝(bioartificial liver,BAL)也因為肝細胞來源問題而進展緩慢,如何進一步解決肝細胞的來源、數(shù)量和活力問題成為了開展HCT治療和BAL技術(shù)的核心問題。胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ES細胞)具有

3、無限增殖和三胚層多向分化的潛能,是再生醫(yī)學(xué)重要的種子細胞,為各種損傷及退行性疾病的細胞治療帶來了新的希望,建立有效的定向誘導(dǎo)分化技術(shù)用于損傷和疾病組織的修復(fù)和替代治療研究是目前ES細胞研究的重要方向。研究表明ES細胞可以在體內(nèi)外成功地分化為肝細胞,這對于各種終末期肝病的細胞治療提供了潛在無限的細胞來源,然而ES細胞誘導(dǎo)分化肝細胞的研究還處于初級階段,目前主要模擬肝臟發(fā)育的機制,通過相關(guān)細胞因子或化合物、基因修飾和共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)ES細胞

4、分化為肝細胞,技術(shù)復(fù)雜、分化效率低下、成本高。本研究使用小鼠胚胎干細胞系ES-D3細胞作為研究對象,建立了兩步法單層誘導(dǎo)ES細胞分化為肝樣細胞的方法,并對誘導(dǎo)分化所得的肝樣細胞從形態(tài)學(xué)、基因表達、蛋白分子標(biāo)記及細胞功能等方面進行了檢測,證明了分化所得細胞為肝細胞,而且分化所得肝細胞脾臟移植到損傷小鼠肝臟后可以歸巢并整合到小鼠損傷肝組織內(nèi)；最后,利用建立的小鼠四氯化碳急性肝損傷模型,通過活體動物實驗檢測了人胎肝細胞系HL-7702作為生物

5、人工肝細胞來源的潛力。
　　 本研究共分為六個部分,第一、二和三部分進行了小鼠胚胎干細胞系ES-D3細胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化,并從細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因表達、蛋白分子標(biāo)記及細胞功能方面進行了全面檢測,誘導(dǎo)分化所得細胞為肝樣細胞；同時對誘導(dǎo)分化過程中,丁酸鈉導(dǎo)致的細胞凋亡現(xiàn)象和細胞周期分布進行了研究,表明EGF可以抑制細胞凋亡。第四部分通過灌胃的方法,建立了小鼠急性四氯化碳肝損傷模型；第五部分將體外DAPI標(biāo)記的分化所得的ES-D3-H

6、ep細胞通過脾臟注射的方法,移植到急性肝損傷小鼠體內(nèi),表明移植的ES-D3-Hep細胞可以整合到損傷的肝組織內(nèi)。第六部分利用建立的小鼠急性四氯化碳肝損傷模型,過腹腔移植人胎肝細胞HL-7702,表明其作為生物人工肝的細胞來源具有潛在的價值。主要的研究結(jié)果如下:
　　 第一部分在小鼠ES-D3細胞的培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化為肝細胞的形態(tài)學(xué)觀察試驗中,以小鼠胚胎干細胞系mESC-D3為實驗材料,應(yīng)用KNOCKOUT-DMEM和KNOCKO

7、UT-SERUM REPLACEMENT建立了小鼠ES細胞無血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,結(jié)合明膠鋪被,初步建立了小鼠ES細胞無血清無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系,通過比較差速貼壁結(jié)合傳代和單純傳代對去除飼養(yǎng)層細胞MEF的效果,結(jié)果表明,差速貼壁結(jié)合傳代去除飼養(yǎng)層細胞MEF的效果好于單純傳代,為ES細胞后續(xù)誘導(dǎo)分化奠定了基礎(chǔ)。同時,mESC-D3細胞通過兩階段單層誘導(dǎo)分化培養(yǎng)共19天,逐漸分化為肝樣細胞,光鏡和透射電鏡對分化細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的觀察表明,分

8、化所得細胞具有肝細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。
　　 第二部分對ES-D3細胞誘導(dǎo)分化所得的ES-D3-Hep細胞的一些標(biāo)志基因的表達進行了檢測,同時對第一階段誘導(dǎo)分化過程中誘導(dǎo)分化劑丁酸鈉產(chǎn)生的細胞凋亡和細胞周期分布進行了檢測。結(jié)果表明,分化所得的ES-D3-Hep細胞表達肝細胞具有的標(biāo)志基因AFP、ALB、TTR和AAT,而自發(fā)分化組細胞只是微弱表達AFP和ALB,不表達肝細胞晚期標(biāo)志物TTR和AAT,提示誘導(dǎo)分化所得的ES-D3-H

9、ep細胞已經(jīng)具備肝細胞具有的基因表達特征,包含不同成熟階段的肝細胞。誘導(dǎo)分化7天,NaB引起細胞凋亡使大量細胞的細胞周期阻滯在S期,而通過添加EGF,可以明顯降低S期細胞周期的比例,增加G0/G1期細胞的比例,抑制細胞凋亡。
　　 第三部分對ES-D3細胞分化所得的ES-D3-Hep細胞進行了相關(guān)重要標(biāo)志蛋白的免疫熒光分析,同時對其肝細胞功能進行了鑒定。結(jié)果顯示,ES-D3-Hep細胞表達肝細胞特異性標(biāo)志蛋白ALB、AFP、CK

10、8和CK18,而自發(fā)分化組也有一些細胞表達ALB和AFP,但不表達CK8和CK18,誘導(dǎo)分化組肝細胞分化率分別為37.27％和41.67％,兩組間差異不顯著,和自發(fā)分化組比較,差異顯著。對ES-D3-Hep細胞進行相關(guān)肝細胞特異性功能檢測,顯示誘導(dǎo)分化組細胞具有代謝ICG的細胞功能,而自發(fā)分化組只有少量細胞具有代謝ICG的細胞功能；PAS實驗顯示ES-D3-Hep細胞具有合成糖原的細胞功能,而自發(fā)分化組細胞染色較少且淡染；這些結(jié)果表明分

11、化所得的ES-D3-Hep細胞具有肝細胞的特異蛋白分子標(biāo)記,同時又具備了肝細胞特異的細胞功能。
　　 第四部分通過灌胃的方法,通過觀察小鼠的行為狀態(tài)、統(tǒng)計死亡率、病理解剖觀察肝臟的病理變化、組織學(xué)觀察肝臟組織病理變化以及檢測血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性的改變,結(jié)果表明,5μl/g四氯化碳劑量灌胃的方法,可以建立穩(wěn)定的小鼠四氯化碳急性肝損傷模型。
　　 第五部分利用已經(jīng)建立的小鼠四

12、氯化碳肝損傷模型,通過脾臟注射的方法,將體外DAPI標(biāo)記的ES-D3-Hep細胞移植到急性肝損傷小鼠體內(nèi),觀察是否具有真正的支持肝臟代謝的功能。結(jié)果表明,ES-D3-Hep細胞經(jīng)DAPI標(biāo)記后,標(biāo)記率可達到100％,臺盼藍染色檢測標(biāo)記后細胞活率與未標(biāo)記細胞相比沒有明顯差別,表明DAPI是一種良好的體外細胞移植示蹤標(biāo)記物；細胞移植后連續(xù)10天觀察小鼠的存活情況,細胞移植組存活率高于溶劑移植組,但差異不顯著；肝臟冰凍切片觀察發(fā)現(xiàn),細胞移植可

13、以觀察到一些散在的藍色熒光點,表明移植的ES—D3-Hep細胞可以整合到損傷的肝組織內(nèi)。
　　 第六部分利用建立的小鼠四氯化碳急性肝損傷模型,使用已經(jīng)建立的正常人胎肝細胞系HL-7702進行腹膜腔移植,觀察對急性肝損傷是否具有代謝支撐功能。結(jié)果表明,細胞移植組(G1)的血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST在移植后第3天和第7天相對于空白對照組(G3)顯著升高(P<0.05),而相對于溶劑移植對照組(G2)顯著降低(P<0.05),而移植后1

14、4天,三組差異不顯著(P>0.05)。小鼠肝臟白蛋白ALB在移植后的第3天和第14天3組差異不顯著(P>0.05),而在移植后的第7天細胞移植組(G1)和空白對照組(G3)差異不顯著(P>0.05),但都與溶劑移植組(G2)差異顯著(P<0.05)。三組實驗動物的組織學(xué)觀察表明,移植后第3天差異不顯著,都表現(xiàn)為嚴(yán)重的組織細胞壞死,而移植后第7天細胞移植組(G1)的損傷程度明顯輕于溶劑移植組(G2),到移植后第14天時,存活小鼠肝臟組織學(xué)