家蠶與果蠅atonal基因功能比較與Atonal結構域分析.pdf

1、神經轉錄因子在左右后生動物的神經系統(tǒng)發(fā)育過程中起著關鍵作用。這些基因都擁有一個bHLH結構域,包括負責DNA結合的basic結構域和負責蛋白與蛋白之間相互作用的helix-loop-helix結構域。這個家族的不同成員在中樞神經系統(tǒng)和外周神經系統(tǒng)中擔任不同的角色。神經轉錄因子atonal(atoDM)是bHLH家族的一個重要成員,在果蠅的視覺神經系統(tǒng)中決定視覺神經元的形成。在果蠅眼的發(fā)育過程中,atoDM的功能主要是決定R8基礎視覺神經

2、細胞分化發(fā)育。在ato1,突變體中(無論是ato1純合,還是與缺失突變體Df(3R)p13雜合體),R8基礎視覺神經細胞基本無法形成,或者只有極個別形成,以致于其后面R1R7視覺神經細胞皆不能形成,最后導致成蟲復眼的整個缺失。
　　 在本課題中,我們克隆了家蠶的atonal司源基因,atoDM。atoDMORF為480bp,編碼159個氨基酸。atoDMC端的bHLH結構域與atoDM的同源性非常高,但兩者N端沒有明顯同源性。我

3、們鑒定了atoDM在家蠶五齡幼蟲眼原基中的表達時相。與atoDM的表達時相類似,atoDM的mRNA在家蠶五齡幼蟲眼原基中也是呈條帶狀表達。我們將atoDM按照果蠅內源的atonal表達時相進行異源表達來補救果蠅ato突變體,實驗結果表明atoDM可以部分替代atoDM的功能。另外,融合蛋白的補救實驗結果表明,雖然atoDM的N端序列與atoDM的N端序列沒有明顯的同源性,但卻可以替代它的功能。而bHLH結構域同源性很高,但是atoDM

4、的bHLH區(qū)域替代atoDM HLH區(qū)域的補救效果卻差很多。也就是說bHLH區(qū)域細微的變化即比整個N端的替換對atonal功能的影響更大。這個結果說明atonal基因的兩個區(qū)域在整個蛋白發(fā)生作用時擔任不同的角色,并且bHLH區(qū)域有直接關系蛋白相互作用的特異氨基酸。
　　 為了進一步研究atoanl基因的功能,我們構建了不同融合蛋白和截短蛋白,以檢測atonal基因不同區(qū)域的功能分工。首先,我們用bHLH保守區(qū)單獨做補救實驗,結果

5、表明bHLH單獨也可以完成atonal整個基因的功能,但是效率要差,補救效果沒有用融合蛋白atoBmDm好。這個實驗結果說明,bHLH可以完成atonal基因的主要功能,但是N端序列也必然有其輔助作用。我們加了不同的功能區(qū)域在bHLH結構域前,然后用這些融合蛋白進行補救實驗,實驗結果顯示只有DNA結合域代替N端區(qū)域時,補救表型才最接近野生型的表型,我們推測N端序列在atonal基因激活下游基因的過程中可能起到結合DNA的作用。另外,由于

6、Ato表達具有嚴格的時相性,我們假設N端序列可能與內源Ato蛋白降解相關。于是我們通過檢測N端序列連接GFP蛋白的表達情況,果然檢測到GFP在系統(tǒng)發(fā)生溝后便有降解。通過軟件預測,在atonal基因N端序列中存在多個泛素化位點和sumo化位點。
　　 在這個課題中,我們除了得到上述實驗結果,還成功運用內源atonal的表達調控元件構建了一個最接近atonal表達時相的GAL4果蠅品系,并且構建了兩套不同的atonal基因補救系統(tǒng)。

7、一套是傳統(tǒng)的基于atonal突變體的atonal失活補救體系,另一套是基于RNAi技術的atonal沉默補救體系。
　　 此外,我們還分析了家蠶神經系統(tǒng)中的離子型γ氨基丁酸(GABA)受體基因家族。我們克隆了家蠶GABAR基因家族5個亞基基因,在已發(fā)表的的昆蟲GABAR家族中是成員數(shù)目最多的,同時我們還分析了GABAR外顯子的可變剪接形式、截斷的轉錄本和RNA編輯位點等,發(fā)現(xiàn)鱗翅目昆蟲存在RDL基因的復制現(xiàn)象,而且RDL基因的R

8、NA編輯位點也是保守的。GABAR在動物神經系統(tǒng)中調節(jié)快速和首要的抑制性神經傳遞,是很多農藥的作用靶標。本研究結果對發(fā)展特異性的殺蟲劑具有意義。
　　 此外,我們還分析了家蠶神經系統(tǒng)中的離子型γ氨基丁酸(GABA)受體基因家族。家蠶GABAR基因家族在已發(fā)表的的昆蟲GABAR家族中是成員數(shù)目最多的,包括3個RDL亞基,一個LCCH3亞基和一個GRD亞基。另外我們還分析了GABAR外顯子的不同剪接形式。其中家蠶RDL1基因包含RN