屏障系統(tǒng)微生物氣溶膠監(jiān)測及SPF級實驗動物微生物多重PCR分析.pdf

1、屏障系統(tǒng)微生物氣溶膠監(jiān)測是屏障環(huán)境監(jiān)測的重要內容，病原微生物氣溶膠可直接影響實驗動物的質量。目前，國內動態(tài)屏障系統(tǒng)微生物氣溶膠監(jiān)測的研究報道較少，也缺乏動態(tài)屏障系統(tǒng)運行情況的評價指標和方法，不利于開展污染源監(jiān)控;屏障系統(tǒng)內實驗動物微生物的檢測主要是采用傳統(tǒng)的生理生化檢驗法，檢測步驟多、周期長，難以適應對屏障內大量動物感染源的篩查要求。本研究通過監(jiān)測動態(tài)屏障微生物氣溶膠的變化規(guī)律及屏障系統(tǒng)有害微生物來源，以期為進一步建立屏障系統(tǒng)微生物氣溶

2、膠監(jiān)控體系提供實驗參考;通過對多重PCR反應體系的優(yōu)化，以期建立屏障系統(tǒng)內實驗動物微生物多重PCR快速分子檢測技術。主要包括2項試驗內容。
　　 1.實驗動物屏障系統(tǒng)微生物氣溶膠監(jiān)測
　　 本試驗以大型實驗動物屏障設施為研究對象，分析屏障設施微生物氣溶膠的動態(tài)變化規(guī)律及其相關影響因素。測定并分析屏障設施各功能區(qū)域不同時間及不同工作狀態(tài)下空氣落下菌和直徑≥0.3um氣溶膠粒子的數量變化。結果表明，屏障系統(tǒng)內空氣落下菌與氣溶

3、膠粒子在飼養(yǎng)工作后顯著升高，噴霧消毒后明顯降低;大、小鼠飼育室空氣落下菌與氣溶膠粒子數在凌晨時明顯升高，而兔飼育室在凌晨時間段則較低;清潔走廊和污物走廊在工作狀態(tài)時細菌含量明顯上升，非工作狀態(tài)時細菌含量一直處于較低的水平。實驗動物屏障系統(tǒng)的環(huán)境微生物與氣溶膠粒子的動態(tài)數量變化與動物品種、空氣消毒、人員進出及動物室內的飼養(yǎng)操作等有關。實驗動物繁殖屏障系統(tǒng)是生產實驗動物的主要場所，在屏障系統(tǒng)運行過程中，人員、物品、動物都在不停地出入屏障。物

4、品經過高壓消毒或高濃度過氧乙酸噴霧或浸泡進入，空氣經過四級過濾進入，動物是由隔離器內傳出的SPF級動物，人員經過沐浴后換無菌服進入，但是屏障系統(tǒng)運行之后即很難完全達到SPF級標準，對屏障系統(tǒng)內人流、物流、動物流進行微生物檢測，發(fā)現飼養(yǎng)人員清潔后仍可從口鼻腔分離到肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌，人員流動可能是造成屏障內污染的主要因素。
　　 2.SPF級實驗動物易感微生物多重PCR檢測技術的建立
　　 本試驗旨在建立SPF級實驗

5、動物易感菌類（主要包括金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和肺炎鏈球菌）的多重PCR快速檢測方法。根據各細菌特有的毒力基因即金黃色葡萄球菌nuc、肺炎克雷伯菌Phoe、銅綠假單胞菌opr(1)和肺炎鏈球菌PspA設計多組特異的引物，通過單一PCR、雙重PCR、多重PCR反應篩選，并對每對引物和隨機混合引物進行單基因組和多基因組特異性分析，得到特異的引物組合。通過對反應溫度Tm值、鎂離子濃度、Taq酶濃度進行優(yōu)化，最終確定4對引物合