優(yōu)質小麥HMW-GS基因成熟肽片段的克隆與種cDNA文庫的構建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、該研究以體細胞雜種F5代灌漿期種子為實驗材料,提取總RNA,根據(jù)所分離的類似普通小麥13號、16號HMW-GS的N-端蛋白測序結果分別設計5′簡并引物,通過RT-PCR擴增分別各得到三條特異的cDNA片段,前者大小為:2.3kb、2.2kb和2.1kb;后者大小為2.5kb、2.2kb和2.1kb.分別將2.3kb和2.5kb大小的片段克隆到pMD18-T載體上(質粒分別命名為p13L-1和p16L-A),插入片段經(jīng)PCR及限制性內切酶

2、酶切驗證后進行序列測定.利用RNA 5′端模板轉換技術(SMART,the Switch Mechanism At the 5′end of RNA Transcript)合成cDNA的第一鏈,再經(jīng)21個循環(huán)的長距離PCR(LD-PCR)合成雙鏈cDNA,雙鏈cDNA的范圍為0.1Kb-10Kb,在2Kb處有較多的PCR產(chǎn)物積累.雙鏈cDNA經(jīng)SfiI(A和B)酶切、CHROMA SPIN-400層析柱除去400bp以下的小分子后與5′

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