轉錄調控因子DNMT3b在肝癌細胞SMMC7721中的作用.pdf

1、肝癌是人體常見的致命性腫瘤，預后差，嚴重威脅人類的健康，因此深入研究肝癌的發(fā)生發(fā)展機制，進而加強肝癌的防治具有重要意義。 隨著分子生物學的發(fā)展，已逐漸認識到表遺傳學(Epigenetics)調節(jié)與腫瘤基因的轉錄調控密切相關：因為這種表遺傳學調節(jié)不改變基因編碼序列，并且是可逆的，因而越來越受到重視。研究表明，表遺傳學或/和遺傳學改變均可引起腫瘤的發(fā)生是一個涉及多種腫瘤基因功能改變的多步驟過程，其中腫瘤抑制基因的功能失活為細胞的惡性

2、轉化所必需。由DNMTs催化完成的DNA甲基化是DNA的一種天然修飾方式，是表遺傳學主要內容之一，其在基因的表達調控、胚胎發(fā)育調節(jié)、基因組印記、X染色體失活及腫瘤的發(fā)生等許多方面發(fā)揮著重要的作用。 在DNMTs家族中，DNMT3b的作用最為重要。DNMT3b主要表達于未分化的胚胎干細胞，催化DNA的從頭甲基化，在正常體細胞中表達很低。CPG島是公認的基因表達調控區(qū)域。大約50﹪的CPG島位于基因啟動子區(qū)域。在正常細胞大部分的啟動

3、子區(qū)域CPG島是未甲基化的。由DNMT3b催化的腫瘤抑制基因啟動子區(qū)CPG島的甲基化反應，使CPG島甲基化狀態(tài)改變導致該基因表達沉默，進而引起腫瘤的發(fā)生。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在肝細胞惡性轉化過程中，F(xiàn)HIT基因(一重要的腫瘤抑制基因)的表達明顯受抑制，用siRNA抑制DNMT3b表達后，F(xiàn)HJIT基因又恢復表達，但這一過程中，F(xiàn)HIT基因啟動子區(qū)域CpG島并未被甲基化，由此提示在肝細胞惡性轉化過程中DNMT3b除發(fā)揮DNA甲基轉移酶作用外

4、尚有轉錄調控因子的作用。事實上，DNMT3b具有PWWP和PHD結構域，而這些結構域與蛋白質．蛋白質間的相互作用有關，說明DNMT3b已經具備了作為信號傳導分子的基礎。以前的研究多集中于DNMT3b作為酶的功能，而其作為轉錄調控因子的功能目前尚未見報道。 信號轉導子和轉錄激活子(Signal transducers and activators of transcription，STATs)是一重要的核轉錄因子．STATs家族成

5、員參與了許多細胞因子、生長因子的信號傳導，在調節(jié)人體免疫反應、炎癥反應和細胞的生長、分化、凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演進有關。據(jù)文獻報道，STATs及其下游基因Bcl-2、CyclinD1．c-myc、VEGF、P21等在肝癌組織中異常表達，而STATs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)不變。有研究表明：STATs及其下游基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。如：Bcl-2、CydinDl．、c-my

6、c、VEGF都是重要的癌基因。它們在肝細胞肝癌的發(fā)生、增殖、分化、凋亡、血管生成和侵襲轉移等多方面都發(fā)揮了重要作用。如果能夠證實DNMT3b與STATs信號傳導通路相關聯(lián)，則提示DNMT3b-STATs信號傳導通路的存在，這就說明DNMT3b即可以作為DNA甲基轉移酶催化基因的甲基化，影響基因的表達，又可以作為轉錄調控因子發(fā)揮作用。這就進一步揭示了DNMT3b功能的多樣性，為腫瘤的基因治療提供新的靶點，為肝癌的防治提供新思路。

7、方法 1、傳代培養(yǎng)SMMC7721細胞； 2、將終濃度為50IlM的DNMT3bsiRNA轉染到肝癌細胞SMMC7721中： 3、在SMMC7721細胞轉染DNM'IBbsiRNA 48h后，收集轉染細胞和未轉染細胞提取細胞質蛋白或總蛋白，用Western blotting檢測DNMT3b的表達改變； 4、在SMMC721細胞轉染DNMT3bsiRNA前及轉染24、48h后，用細胞計數(shù)板計數(shù)轉染細胞和未轉

8、染細胞的細胞數(shù)量； 5、用Westem blotting檢測STATs及其下游基因c-myc，VEGF．，CyclinD1等的表達改變情況； 6、處理所得數(shù)據(jù)，得出結論。 結果 1、在SMMC7721細胞轉染DNMT3bsiRNA 48h后，通過Western Blotting檢測DNMT3b的表達發(fā)現(xiàn)：轉染細胞的DNMT3b表達水平比未轉染細胞明顯降低。 2、轉染細胞的生長速度與未轉染細胞相比明

9、顯受到抑制，統(tǒng)計學上有顯著性差異(P<0.05)，同時有大量死亡細胞存在。 3、轉染細胞的STATl、STAT3、STATS及其下游基因VEGF、c-myc、CyclinD1的表達水平與未轉染細胞相比均降低。 結論 1、DNMT3bsiRNA的建立可以方便地研究DNMT3b的功能。通過DNMT3bsiRNA特異性的抑制DNMT3b的表達。 2、在SMMC7721細胞體系中存在DNMT3b-STATs信號傳導通路，