RAGE在MGO誘導Jurkat細胞分泌炎癥因子TNF-α和IFN-γ中的作用.pdf

1、目的：甲基乙二醛（MGO）是葡萄糖活性代謝產物，晚期糖化終產物受體（RAGE）可抑制MGO代謝的關鍵酶乙二醛酶1（GLO-1）。MGO和晚期糖化終產物受體的水平在糖尿病人中明顯增高，與糖尿病加速動脈粥樣硬化有關，但它們之間相互作用在糖尿病加速動脈粥樣硬化中的意義仍不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MGO誘導Jurkat細胞分泌炎癥因子TNF-α、IFN-γ。本實驗將進一步研究RAGE及其胞內信號對MGO誘導的Jurkat細胞分泌TNF-α和I

2、FN-γ的影響，為了解糖尿病加速動脈粥樣硬化機制提供了實驗基礎。
　　方法：①不同濃度的MGO（0、15、30、60μM）作用PHA（0.25μg/ml）預刺激的Jurkat細胞24h，Western blot檢測RAGE表達。②不同濃度MGO（0、15、30、60μM）作用于PHA預刺激的Jurkat細胞24h，ELISA檢測TNF-α和IFN-γ的分泌；部分實驗加RAGE抗體（1μg/ml）預處理，同時設非特異抗體（1μg/m

3、l）為對照。③不同濃度MGO（0、15、30、60μM）作用PHA預刺激的Jurkat細胞24h,Western blot測鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IV（CaMKIV）的表達；部分實驗加RAGE抗體（1μg/ml）預處理，同時設非特異抗體（1μg/ml）為對照。免疫熒光檢測30μM MGO作用0、15、30、60min后的Jurkat細胞內CaMKIV轉核情況；部分實驗加RAGE抗體（1μg/ml）預處理，同時設非特異抗體（1μg/ml）

4、為對照。④30μM MGO作用PHA預刺激24h的Jurkat細胞0、15、30、60min，Western blot檢測p38MAPK磷酸化表達；部分實驗加RAGE抗體（1μg/ml）預處理，同時設非特異抗體（1μg/ml）為對照。⑤30μM MGO作用于CaMKIV抑制劑KN62（10μM）、p38 MAPK抑制劑SB203580（25μM）預處理的Jurkat24h，ELISA檢測TNF-α和IFN-γ的分泌。
　　結果：①

5、MGO作用于PHA預刺激的Jurkat細胞24小時，Western Blot顯示Jurkat細胞表達RAGE，15、30、60μM MGO均上調RAGE的表達，與MGO未作用組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。②15、30、60μM MGO作用于Jurkat細胞24h可促使Jurkat細胞分泌TNF-α及IFN-γ，與MGO未作用組比較差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。RAGE抗體能抑制MGO誘導Jurkat細胞分泌TNF-α及IF

6、N-γ（p<0.05），而非特異抗體預處理對MGO誘導Jurkat細胞分泌TNF-α及IFN-γ無影響（p>0.05）。③15-60μM MGO能增加CaMKIV的表達，與MGO未作用組比較差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。RAGE抗體抑制MGO誘導的CaMKIV的表達（p<0.05）；而非特異抗體預處理對MGO誘導CaMKIV的表達無影響（p>0.05）。免疫熒光顯示30μM MGO作用15-60min促進Jurkat細胞CaMKIV

7、核轉位；RAGE抗體抑制MGO誘導的CaMKIV蛋白核轉位，而非特異抗體預處理對MGO誘導CaMKIV蛋白核轉位無影響。④30μM MGO作用Jurkat細胞15-60min引起Jurkat細胞內p38MAPK磷酸化表達增加（p<0.05）；RAGE抗體抑制MGO引起的p38MAPK磷酸化（p<0.05），而非特異抗體預處理對MGO誘導p38MAPK磷酸化無影響（p>0.05）。⑤CaMKIV，p38MAPK通路抑制劑預處理抑制MGO誘