GSK-3β、mTOR在Fmr1基因敲除小鼠脊髓水平的痛覺調制中的作用.pdf

1、脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是一種常見的遺傳性智力低下疾病，它的遺傳學基礎是由于X連鎖的脆性X智力低下一號基因（fragile X mental retardation gene1，F(xiàn)mr1）5’端的(CGG)n三核苷酸重復序列擴增異常及與其相鄰的CpG島異常甲基化,致使Fmr1基因編碼的產物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)缺如或減少

2、所致。脆性X綜合征有一個顯著的特點是患者有痛覺敏感性下降導致的自我傷害行為。還有不同程度的智力低下,學習記憶力減退，活動過度，以及癲癇患病率增高等癥狀。而Fmr1基因敲除小鼠（Knockout mice，KO鼠）也有許多上述類似表現(xiàn)。因此，我們推測Fmr1基因敲除小鼠痛覺處理系統(tǒng)異常，可能存在痛覺敏感性下降。目前，F(xiàn)XS患者的自殘行為的神經(jīng)生物學機制尚不明了，本研究小組的前期研究發(fā)現(xiàn) Fmr1基因敲除小鼠皮層和海馬的絲氨酸-磷酸化-糖原

3、合成酶激酶-3（serine-phosphorylation of GSK3，P-GSK3）表達減少，鋰劑可以通過增加P-GSK3的表達來改善KO鼠學習記憶減退的表型。有研究顯示神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）可通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）信號途徑激活糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK3）而改變小鼠痛覺的

4、敏感性。在KO鼠的脊髓中P-GSK3的表達是否存在異常，KO鼠痛覺敏感性下降是否與此有關？這些問題都有待于進一步研究和探討。
　　有研究表明哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通過調節(jié)蛋白質的合成，影響突觸傳遞效能，參與長時程增強（long term potentiation，LTP）的形成，介導痛覺的中樞敏化，從而參與病理性疼痛的形成與維持；還有研究顯示 GSK3可通過

5、TSC1/2復合體（the tuberous sclerosiscomplex1/the tuberous sclerosis complex 2）對mTOR的活性進行調節(jié)；這些研究結果提示mTOR參與了痛覺的調制并可能受到GSK3的調節(jié)。但mTOR是否參與Fmr1基因敲除小鼠痛覺異常的形成機制，與GSK3的關系又是如何？目前尚不清楚。
　　本研究旨在探索Fmr1基因敲除小鼠是否存在痛覺敏感性下降，在脊髓水平初步探索磷酸化絲氨酸-

6、9-糖原合成酶激酶-3β（phospho-Ser9-GSK3β，P-GSK3β）及mTOR在Fmr1基因敲除小鼠痛覺敏感性改變的機制中的作用及兩者之間的關系，初步探討FXS患者自殘行為的生物學機制。
　　【研究目的】
　　本研究通過對Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠（Wild type mice，WT鼠）的熱刺激縮足反射潛伏期（PWTL）的測定，明確KO鼠的痛覺敏感性是否下降；同時通過免疫組織化學方法，蛋白免疫印跡實驗，觀察

7、KO鼠腰骶膨大段脊髓后角的GSK3β，P-GSK3β及mTOR的表達與WT鼠是否有差別；并了解使用GSK3抑制劑氯化鋰后，KO鼠的痛覺異常能否恢復至WT鼠的水平，脊髓中GSK3β、P-GSK3β及mTOR表達是否發(fā)生改變及它們之間的相互關系，初步探討它們在Fmr1基因敲除小鼠在脊髓水平痛覺敏感性改變機制中可能的作用。
　　【材料和方法】
　　1.實驗動物：純合子（-/-）Fmr1基因敲除型（KO）及其純合子(+/+)野生型(

8、WT) FVB近交系小鼠。
　　2.動物基因型鑒定：采用PCR法檢測實驗小鼠的Fmr1基因片段。
　　3.動物分組：
　　3.1、用于痛覺敏感性測定的8周齡的45只KO鼠及45只WT鼠均分成空白對照組、生理鹽水組和氯化鋰組，每組15只。4周齡的小鼠只設KO組及WT組，每組15只。
　　3.2、用于免疫組織化學實驗8周齡的12只KO鼠及12只WT鼠均分成空白對照組、生理鹽水組和氯化鋰組，每組4只。4周齡的小鼠只設K

9、O組及WT組，每組4只。
　　3.3、用于蛋白免疫印跡實驗8周齡的12只KO鼠及12只WT鼠均分成空白對照組、生理鹽水組和氯化鋰組，每組4只。4周齡的小鼠只設KO組及WT組，每組4只。
　　4.實驗方法及觀測指標：8周齡小鼠第一天測定PWTL值，作為基礎痛閾，第2，3，4，5天均按4mmol/kg腹腔注射氯化鋰，給藥30分鐘后測定PWTL值，第6天給藥30分鐘后灌注固定取腰骶膨大段脊髓行免疫組織化學實驗，或脫臼處死取脊髓行蛋

10、白免疫印跡實驗。4周齡小鼠只測第一天的基礎痛閾。觀察KO鼠與WT鼠的基礎痛閾是否不同，使用氯化鋰后8周KO及8周WT鼠痛覺敏感性如何變化，并通過蛋白免疫印跡實驗及免疫組織化學實驗對8周KO及8周WT鼠用藥前后腰骶膨大段脊髓的GSK3β、P-GSK3β和mTOR的表達做定量和定性分析。
　　5.數(shù)據(jù)及圖像的采集：PWTL值通過PL-200熱刺痛儀打??；免疫組織化學實驗結果用光密度法分析，免疫印跡實驗結果用光密度法（Quantity

11、One）定量，用同一塊膠上的目的蛋白與內參蛋白測得值的比值作為統(tǒng)計分析數(shù)值。
　　6.統(tǒng)計方法：所有結果均用`X±S表示，用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析；KO與WT小鼠所有實驗參數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗；KO及WT用藥前后實驗參數(shù)的比較采用單因素方差分析，所有的檢驗P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　【實驗結果】
　　1.經(jīng)基因鑒定，KO組小鼠均為純合子（-/-）Fmr1基因敲除型；WT組小鼠均為純合子(+/+)野生型

12、。
　　2.行為學實驗結果：4周齡及8周齡KO鼠的基礎痛閾均比同周齡的WT鼠的基礎痛閾高，即4周齡及8周齡KO鼠痛覺敏感性低。8周齡KO鼠使用氯化鋰后痛覺閾值下降，且與同周齡WT鼠相比，差異無統(tǒng)計學意義，即8周齡KO鼠使用氯化鋰后痛覺敏感性恢復正常。
　　3.免疫組織化學實驗結果：GSK3β、P-GSK3β、mTOR廣泛表達于脊髓灰質的神經(jīng)元的胞漿中，部分前角神經(jīng)元可見胞核中有P-GSK3β表達，與同周齡的WT鼠相比，4周齡

13、及8周齡 KO鼠脊髓腰骶膨大段后角邊緣層及膠狀質的P-GSK3β、mTOR的表達明顯減少。使用氯化鋰后，8周齡 KO鼠脊髓腰骶膨大段后角邊緣層及膠狀質的P-GSK3β及mTOR的表達均增多，而8W齡WT鼠的變化不明顯。4周齡及8周齡 KO鼠脊髓腰骶膨大段后角邊緣層及膠狀質的GSK3β的表達和WT鼠無明顯差別。與用藥前相比，8周齡KO鼠及WT鼠脊髓腰骶膨大段后角邊緣層及膠狀質的GSK3β的表達均無明顯改變。
　　4.免疫印跡實驗結果

14、：與同周齡的WT鼠相比，4周齡及8周齡KO鼠脊髓腰骶膨大段P-GSK3β、mTOR的表達明顯減少。使用氯化鋰后，8周齡KO鼠脊髓腰骶膨大段P-GSK3β及mTOR的表達均增多，而8W齡WT鼠的變化不明顯。4周齡及8周齡KO鼠脊髓腰骶膨大段的GSK3β的表達和WT鼠無明顯差別。與用藥前相比，8周齡KO鼠及WT鼠脊髓腰骶膨大段的GSK3β的表達均無明顯改變。
　　【結論】
　　1．KO鼠熱痛覺閾值增高，熱痛覺敏感性降低。