RNA干擾抑制髓母細胞瘤D341細胞株c-myc基因表達的研究.pdf

1、目的： 體外研究RNA干擾對人髓母細胞瘤D341細胞株c-myc基因的沉默，探討SiRNA轉染濃度、轉染時間和目的基因表達之間的相關性；同時觀察沉默c-myc基因后，在一定轉染濃度、轉染時間，RNA干擾對細胞周期和細胞凋亡的影響。 方法： 不同濃度c-myc SiRNA轉染D341細胞，24小時后抽取總RNA和總蛋白質，分別以RT-PCR和Western-blot檢測C-myc mRNA和C-myc蛋白的表達；同

2、時在轉染后的24、48小時之后流式細胞儀檢測和凋亡的變化。另外以100nM的C-myc SiRNA轉染D341細胞，12、24、48、72小時之后抽取總RNA和總蛋白質，RT-PCR檢測C-myc mRNA表達，Western-blot方法檢測C-mye蛋白的表達；同時細胞滴片，免疫細胞化學檢測。 結果： 200nM、100nM、50nM、25nM濃度SiRNA轉染的D341細胞，C-mye RNA表達均下降，與空白對照

3、組和陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Westem-blot檢測C-myc蛋白表達量，隨著轉染濃度的增加，SiRNA對C-mye蛋白的沉默效應增加。隨著轉染時間的增加，在24小時，對C-myc在RNA水平沉默效應最明顯，在蛋白水平則在48小時出現(xiàn)最高沉默效應。轉染細胞SiRNA濃度在100nM時，24小時后流式細胞儀檢測，G1期細胞分布在72％-78％，s期細胞分布在16％-23％，空白對照組S期細胞分布在32-36％，

4、G1期細胞分布在53-56％，細胞凋亡不明顯。免疫細胞化學染色，表明SiRNA對C-myc蛋白的抑制隨著濃度的增加效應增加，在時間點上，48小時出現(xiàn)最高沉默效應。 結論： 1．實驗所選擇的轉染片斷，在RNA水平及蛋白水平均對C-myc基因實施了沉默，沉默效率較高，是有效的沉默片斷。 2．在25nM、50nM、100nM、200nM濃度范圍內，隨著SiRNA濃度的增加，在RNA及蛋白水平均顯示，對目的基因的沉默越明

5、顯。低濃度SiRNA即可抑制目的基因的表達，SiRNA對目的基因的抑制與轉染濃度成線性相關。 3．在12、24、48、72小時內，對C-myc基因在RNA水平達到最大沉默效應是在轉染24小時，而在蛋白水平，則在轉染48小時后出現(xiàn)最高沉默效應。 4．SiRNA抑制C-myc的表達使細胞阻滯在G1期，S期細胞減少，使細胞由G1期到S期的轉化停滯。 5．沉默C-myc基因后，D341細胞生長明顯受抑制，但并不增加細胞凋