蛇床子素(osthole)對(duì)肝細(xì)胞肝癌的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一章蛇床子素抗肝細(xì)胞肝癌作用的研究
　　目的：研究蛇床子素抗肝癌作用及其特點(diǎn)。
　　方法：采用MTT方法和流式細(xì)胞術(shù)觀察蛇床子素對(duì)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株增殖、凋亡和周期的影響；應(yīng)用SMMC-7721裸鼠肝癌模型和Hepa1-6 C57小鼠肝癌模型觀察蛇床子素在體的抗肝癌效應(yīng)和毒性，及其在肝癌小鼠體內(nèi)的吸收和分布研究。
　　結(jié)果：
　　1）蛇床子素對(duì)人肝癌細(xì)胞SK-HEP-1、SMMC-7721和HepG-2，小鼠肝

2、癌細(xì)胞Hepa1-6的增殖均有抑制作用，且有劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系；也可抑制正常肝細(xì)胞的增殖，但其IC50高于四株肝癌細(xì)胞，表現(xiàn)為其細(xì)胞毒性是有選擇性的。
　　2）蛇床子素可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6的凋亡，對(duì)周期進(jìn)程阻滯在G2期。
　　3）蛇床子素可抑制裸鼠和C57小鼠肝癌模型的腫瘤生長(zhǎng)，腹腔注射給藥方式優(yōu)于口服灌胃。
　　4）蛇床子素可以進(jìn)入肝癌小鼠血流較豐富的組織（包括腫瘤），其轉(zhuǎn)運(yùn)

3、機(jī)制主要為簡(jiǎn)單的被動(dòng)擴(kuò)散。
　　結(jié)論：蛇床子素是一種低毒、具有抗肝癌效應(yīng)的天然化合物。
　　第二章蛇床子素誘導(dǎo)肝細(xì)胞肝癌凋亡機(jī)制的研究
　　目的：闡明蛇床子素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用Real-time PCR方法觀察蛇床子素對(duì)凋亡相關(guān)84個(gè)基因表達(dá)的影響；采用western blot和EMSA技術(shù)觀察蛇床子素對(duì)Bax、Bcl-2、Caspase、PARP、CyclinB、NF-κB蛋白水平以及PI

4、3K/Akt通路調(diào)節(jié)的影響；并采用MTT法觀察蛇床子素與Trail聯(lián)合用藥對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　1）蛇床子素可以使28個(gè)凋亡相關(guān)因子表達(dá)升高，其中TNF受體（占21.43%）和TNF配體（占17.86%）家族所占比例最高。
　　2）蛇床子素可以上調(diào)肝癌細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，使Bax/Bcl-2的比值增高；促進(jìn)Caspase-3、Caspase-8和Casp

5、ase-9的活化，PARP蛋白酶的剪切；下調(diào)周期蛋白Cyclin B1的表達(dá)。
　　3）蛇床子素可抑制肝癌細(xì)胞中NF-κB的活化，有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。
　　4）蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞中總Akt表達(dá)無(wú)影響，可下調(diào)磷酸化Akt和PI3K二個(gè)亞基（p110和p85）蛋白的表達(dá)。胰島素可以減弱蛇床子素對(duì)磷酸化Akt和PI3K p110亞基蛋白表達(dá)的下調(diào)，而LY294002可增強(qiáng)其下調(diào)作用。
　　5）蛇床子素可增強(qiáng)TRAIL對(duì)SMM

6、C-7721肝癌細(xì)胞增殖的抑制，但隨著蛇床子素濃度的增加，其增強(qiáng)作用逐漸減弱。
　　結(jié)論：蛇床子素誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制是多靶點(diǎn)和多通路；可能作用于與TRAIL相同的靶點(diǎn)，其機(jī)制為通過(guò)抑制PI3K/Akt通路的激活，從而抑制NF-κB的活化，下調(diào)周期蛋白CyclinB，阻滯細(xì)胞在G2/M期；同時(shí)可以上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，激活Caspase-9；并通過(guò)死亡結(jié)構(gòu)受體激活Caspase-8，繼而激活Caspase-3，促進(jìn)PARP的剪切，從而誘導(dǎo)

7、肝癌細(xì)胞凋亡。
　　第三章蛇床子素對(duì)抗腫瘤免疫功能的增強(qiáng)效應(yīng)
　　目的：研究蛇床子素對(duì)肝癌小鼠免疫系統(tǒng)的影響，進(jìn)一步從免疫增強(qiáng)角度探討蛇床子素抗肝癌的作用機(jī)制。
　　方法：采用MTT法觀察蛇床子素對(duì)體外培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用Hepa1-6 C57小鼠肝癌模型，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定小鼠脾臟中各淋巴細(xì)胞亞群和ELISA法測(cè)定血清中IL-2、TNF-α水平，觀察蛇床子素對(duì)小鼠抗肝癌免疫反應(yīng)的影響。
　　結(jié)果：

8、r>　　1）低濃度的蛇床子素可以促進(jìn)未刺激和ConA、LPS刺激下小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。
　　2）蛇床子素對(duì)肝癌小鼠的胸腺重量和胸腺指數(shù)無(wú)影響，對(duì)脾臟重量和脾臟指數(shù)有增高趨勢(shì)。
　　3）蛇床子素對(duì)肝癌小鼠脾臟中B細(xì)胞的比例和數(shù)量，及其活化和成熟均無(wú)影響；有升高巨噬細(xì)胞、CD4+T和CD8+T細(xì)胞的比例和數(shù)量的趨勢(shì)，對(duì)CD4+/CD8+比值保持在正常水平，并可提高腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細(xì)胞的比例。
　　4）蛇床