Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制.pdf

1、目的： Fas也稱Apo-1或CD95，是腫瘤壞死因子(TNFR)/神經(jīng)生長因子受體(NGFR)家族的一個代表，在生理和病理的凋亡過程中廣泛涉及，如腫瘤監(jiān)視、免疫功能、爆發(fā)性肝炎和神經(jīng)再生等。Fas曾經(jīng)在抗癌治療中被使用，然而在治療應(yīng)用上Fas受到很大限制，這是由于它的毒性和激活NF-kB家族轉(zhuǎn)錄因子，NF-kB易引起炎癥和抗凋亡的作用。在體外，為了克服這些問題，特殊的NF-kB抑制劑、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成抑制劑放線菌素D被應(yīng)用，通過

2、放線菌素D(actinomycin D，AD)處理細胞，使對Fas抗體介導(dǎo)的凋亡不敏感的細胞株變得敏感，這是由于放線菌素D能激活細胞內(nèi)信號，在誘導(dǎo)凋亡過程中提供了與Fas協(xié)同的共刺激信號，從而促進細胞凋亡。 凋亡或程序性死亡在胚胎形成和發(fā)展中是重要的現(xiàn)象，它維持著機體的自我平衡。對于敏感細胞，當Fas受體與Fas配體或可溶性Fas抗體相結(jié)合時，F(xiàn)as受體三聚化作用導(dǎo)致細胞凋亡．對于Fas抗體誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制已經(jīng)進行了初步的

3、研究，在Fas-AD誘導(dǎo)的細胞凋亡過程中可以激發(fā)多個信號途徑，其中以caspase蛋白激酶執(zhí)行細胞有秩序的死亡而聞名。 在哺乳動物細胞，凋亡是以依賴線粒體途徑和非依賴線粒體途徑兩條途徑促進細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑中起到一個中心作用。Bcl-2家族蛋白的作用位點主要在線粒體膜上，能刺激線粒體細胞色素C的釋放，細胞色素C與Apaf-1一起激活caspase-9，easpase-9激活easpase-3隨之導(dǎo)致

4、凋亡。對于非依賴線粒體途徑：主要通過死亡受體(FaLs associated death domain，F(xiàn)ADD)作用激活easpase-8，進而激活下游的easpase-3，從而引起細胞凋亡。Caspase-8除了直接激活caspase-3外，還可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路間接激活caspase-3。 在兩個途徑中，最后步驟涉及到依靠大量的多蛋白復(fù)合體caspase從鈍化的形式變?yōu)榧せ钚问剑坏┘せ?，caspase斷裂各種底物導(dǎo)致細胞死

5、亡，在此過程中caspase-8是頂端的caspase，對于啟動Fas誘導(dǎo)的凋亡是非常重要的。在caspase亞家族中，對于理解凋亡，caspase-3由于其易變底物的特殊性而尤其重要。 RB腫瘤抑制蛋白在通過G1/S調(diào)控點調(diào)節(jié)細胞周期中起主導(dǎo)作用，參與細胞周期的調(diào)節(jié)。通常認為失活的RB在G1/S臨界點通過磷酸化釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細胞周期基因表達，加速S期進入引起細胞增殖。RB還有很多其他的細胞功能，包括介導(dǎo)分化的信號，在有

6、絲分裂過程中調(diào)節(jié)染色體分離，維持基因的完整性。擾亂這些RB功能的途徑能潛在的引起增殖的增高或基因的不穩(wěn)定導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 有絲分裂原蛋白激酶已經(jīng)被暗示是凋亡的上游信號，包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5亞家族。在哺乳動物細胞，它們是由不同的外界刺激物(如紫外線和滲透性刺激等)調(diào)節(jié)的獨立模型，通過傳導(dǎo)不同信號導(dǎo)致細胞的增殖、分化和凋亡。在死亡受體誘導(dǎo)凋亡的過程中，這個途徑的作用還不太清楚，可能依靠特殊的死亡受體和細胞類型。

7、 目前，關(guān)于Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402腫瘤細胞凋亡的過程中，P38MAPK與caspase-8是否一起參與，P38MAPK與caspase家族之間的關(guān)系，以及P38MAPK、caspase與Bcl-2、Rb的關(guān)系還不清楚，本研究利用Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡，通過P38MAPK抑制劑SB203580及caspase-8抑制劑Ac-IEFD-cho的作用，來確定P38MAPK、caspase-8、caspase

8、-3及Bcl-2、RB的關(guān)系，進一步揭示Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 方法： 1、通過MTT法檢測Fas-AD作用后的Bel-7402細胞活力，濃度下的不同作用時間點檢測。 2、通過倒置顯微鏡、電子顯微鏡和流式細胞儀檢測在Fas抗體不同F(xiàn)as、Fas-AD、SB203580(P38MAPK 特異性抑制劑)及Ac-IEFD-cho(caspase-8特異性抑制劑)對Bel-7402細胞凋

9、亡的影響。 3、通過Western-blot法、RT-PCR法檢測Fas-AD、SB203580及Ac-IEFD-cho對培養(yǎng)的Bel-7402細胞的P38MAPK、caspase-8、caspase-3的激活作用，對FasR、Bcl-2、RB表達的影響及其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 4、利用激光共聚焦顯微鏡通過免役熒光法檢測Fas-AD、SB203580及Ac-IEFD-cho作用后P38MAPK與caspase-3的細胞內(nèi)定位。

10、 5、通過免疫沉淀法確定P38MAPK與caspase-3的作用關(guān)系，caspase-3與RB的作用關(guān)系及其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 結(jié)果： 1、Fas-AD能明顯抑制Bel-7402細胞增殖，且隨Fas抗體濃度及其作用時間呈依賴關(guān)系。 2、Fas-AD能明顯誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡，SB203580和Ac-IEFD-cho能明顯抑制Fas-AD誘導(dǎo)的細胞凋亡。 倒置顯微鏡下觀察顯示，F(xiàn)as-AD作

11、用24 h后能明顯地誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡，細胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡，核仁的數(shù)量減少，死亡細胞較多。SB203580和Ac-IEFD-cho分別單獨作用時能改善這種現(xiàn)象，死亡細胞相對較少；當兩個抑制劑共同作用時能明顯改善這種現(xiàn)象，細胞質(zhì)出現(xiàn)微量小泡，核仁較多。 電子顯微鏡下觀察顯示，F(xiàn)as-AD作用24 h后，Bel-7402細胞出現(xiàn)典型的凋亡特征，細胞體積變小，胞質(zhì)濃縮，胞漿內(nèi)空泡增多，染色質(zhì)固縮、邊集或碎裂成不規(guī)則塊狀，出現(xiàn)

12、凋亡小體。SB203580組和Ac-IEFD-cho組可見細胞膜相結(jié)構(gòu)完整，胞漿內(nèi)空泡相對減少，染色質(zhì)邊緣聚集，線粒體腫脹。SB203580和Ac-IEFD-cho共同作用組，未出現(xiàn)明顯的凋亡特征，胞漿可見少量小泡。 Annexin-V FITC/PI雙標流式細胞術(shù)分析顯示：Fas-AD作用24 h后，與對照組比較Fas-AD組能明顯誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡，凋亡率為50.55±3.25％，SB203580和Ac-IEFD-

13、cho單獨或共同作用都能明顯的抑制Fas-AD誘導(dǎo)的凋亡。 3、Fas-AD能明顯誘導(dǎo)Bel-7402細胞FasR表達。 Westem-bolt結(jié)果顯示，F(xiàn)as-AD誘導(dǎo)培養(yǎng)的Bel-7402細胞的FasR表達，并且FasR隨Fas抗體濃度呈劑量依賴性增加，但當Fas抗體濃度為10 μM時，F(xiàn)asR表達增加量減緩。 4、P38MAPK與caspase-8參與Fas-AD凋亡途徑，并且相互調(diào)節(jié)。 P38MA

14、PK抑制劑SB203580和caspase-8抑制Ac-IEFD-cho阻礙FaS-AD誘導(dǎo)凋亡的作用明顯顯示，P38MAPK和caspase-8在Fas-AD誘導(dǎo)的凋亡中起重要作用。 5、在Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡過程中，通過抑制劑SB203580和Ac-IEFD-cho的作用發(fā)現(xiàn)P38MAPK和caspase-8調(diào)節(jié)Bcl-2、Rb的表達，P38MAPK和caspase-8能明顯地降低BCl-2的表達，增加R

15、B的表達。 6、P38MAPK和caspase-8調(diào)節(jié)caspase-3的表達。 Western-blot結(jié)果顯示，F(xiàn)as-AD誘導(dǎo)caspase-3表達并發(fā)生斷裂激活，并且斷裂片段表達隨Fas抗體濃度增加呈劑量依賴性增加，而抑制劑SB203580和Ac-IEFD-cho能明顯地抑制其表達和激活。 7、當Fas-AD作用Bel-7402細胞24 h時，在Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡過程中P38MAPK

16、與caspase-3從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞核形成P38MAPK/caspase-3復(fù)合體，而抑制劑SB203580和Ac-IEFD-cho能明顯地抑制他們的轉(zhuǎn)位。 8、當Fas-AD作用Bel-7402細胞48 h時，caspase-3與RB相互作用并形成caspase-3/RB復(fù)合體。 結(jié)論： 1、Fas-AD抑制Bel-7402細胞增殖，誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡。 2、Fas-AID經(jīng)P38MAPK、

17、caspase-8信號通路誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡。 3、在Fas-AID誘導(dǎo)Bel-7402細胞凋亡過程中，P38MAPK與caspase-8相互調(diào)節(jié)，不僅從蛋白總量而且還從激活(磷酸化形式或斷裂形式)的表達上相互影響，再有從mRNA水平也相互調(diào)節(jié)。 4、Fas-AD通過激活P38MAPK、caspase-8從而引起caspase-3的激活，作用下游底物Bcl-2、RB調(diào)節(jié)其表達。 5、在Fas-AD誘導(dǎo)B