RNA干擾VEGF在人滋養(yǎng)細胞中作用的研究.pdf

1、目的：檢測早孕絨毛、蛻膜組織和絨癌JAR細胞VEGF基因表達，構建針對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothel ial growth factor．VEGF)mRNA的特異性的RNA干擾質(zhì)粒載體，觀察轉(zhuǎn)染后VEGF的RNA干擾抑制效應，探討VEGF在體外對滋養(yǎng)細胞的作用，建立RNA干擾技術平臺，為以后研究妊娠并發(fā)癥的發(fā)病機制，基因診斷與基因治療提供技術手段。 方法：1．收集20例正常早期妊娠(7-8周)人工流產(chǎn)者絨

2、毛和蛻膜，同時對購置的人絨癌JAR細胞進行復蘇培養(yǎng)，采用RT-PCR法檢測絨毛、蛻膜及JAR細胞株VEGF基因的表達；2．設計合成兩對針對VEGF mRNA的RNA干擾核苷酸序列，進行兩輪PCR，采用TA克隆對第二輪PCR產(chǎn)物(shVEGF和shVEGF2)進行克隆，然后將TA克隆產(chǎn)物和pSUPER質(zhì)粒分別行EcoR工和HindIII雙酶切和膠回收，最后將酶切的pSUPER空載體質(zhì)粒與TA克隆酶切片段進行定向連接，轉(zhuǎn)化，再次克隆擴增，抽

3、提pSUPER質(zhì)粒；3．首先將人絨癌JAR細胞復蘇、傳代、培養(yǎng)后分組，第1組為空白對照組，第2組為轉(zhuǎn)染空pSUPER載體組，第3組為轉(zhuǎn)染pSUPER-shVEGFl載體質(zhì)粒組，第4組為轉(zhuǎn)染pSUPER-shVEGF2的載體質(zhì)粒組。在脂質(zhì)體介導下，將空白質(zhì)粒及構建的載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染2、3、4人絨癌JAR細胞株，然后篩選轉(zhuǎn)染后細胞株克隆；4．觀察轉(zhuǎn)染細胞的生長情況，流式細胞學檢測細胞增殖情況，RT-PCR法檢測RNA干擾后VEGF的基因表達

4、。 結果：1．正常早期妊娠絨毛、蛻膜組織及JAR細胞中均有VEGF表達，其中蛻膜組織及JAR細胞中的VEGF呈強表達，而絨毛組織vEGF表達強度明顯低于蛻膜組織和JAR細胞。2．限制性內(nèi)切酶酶切圖譜顯示TA克隆產(chǎn)物及pSUPER載體酶切成功，DNA測序結果顯示pMD18-T／PCR-shVEGF2無堿基錯配。3．轉(zhuǎn)染后的JAR細胞株的shVEGFl和shVEGF2質(zhì)粒表達穩(wěn)定，shVEGF2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NVEGF基因表達明顯受

5、抑，shVEGF1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組VEGF完全不表達，體外轉(zhuǎn)染shVEGF后細胞周期無明顯變化。 結論：1．成功構建T VEGF基因mRNA特異性RNA干擾質(zhì)粒載體；2．建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER-shVEGFl，pSUPER-shVEGF2干擾質(zhì)粒的JAR細胞株；3．轉(zhuǎn)染shVEGF2后JAR細胞株內(nèi)VEGF基因表達明顯減少，轉(zhuǎn)染shVEGF1的JAR細胞株內(nèi)VEGF基因表達沉默；4．JAR細胞內(nèi)的VEGF被RNA干擾后，其生長