體外誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細胞向胰島樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、第一部分、人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性觀察
　　 目的：觀察人脂肪間充質(zhì)干細胞(human adipose-derived stem cells，hADMSCs)的形態(tài)學(xué)，生長動力學(xué)及細胞表面標志抗原。
　　 方法：采用酶消化法分離培養(yǎng)脂肪問充質(zhì)干細胞，倒置相差顯微鏡下觀察其生長和形態(tài)學(xué)變化；流式細胞技術(shù)分別檢測細胞周期和原代、第2代、第4代脂肪間充質(zhì)干細胞表面抗原CD31、CD34、CD44、CD29的表達。<

2、br>　　 結(jié)果：
　　 1.在脂肪組織中存在能不斷增殖的未成熟細胞，經(jīng)多次傳代后仍保留很強的增殖能力，倒置相差顯微鏡下觀察呈成纖維細胞樣。
　　 2.流式細胞周期檢測顯示G1期細胞占絕大多數(shù)，達到89.055％，S期為10.945％，表明大多數(shù)細胞處于靜止期，是一群處于未分化狀態(tài)的非定向細胞。
　　 3.其形態(tài)學(xué)及表面標記物與骨髓間充質(zhì)干細胞類似，問充質(zhì)干細胞相關(guān)的表面抗原CD29、CD44隨著傳代表達水平逐

3、漸增高，與原代細胞比較沒有顯著差異(p＞0.05)，內(nèi)皮細胞標志CD31陰性表達。造血干細胞標志CD34隨細胞培養(yǎng)時間延長表達水平明顯降低，與原代細胞比較有顯著差異(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:通過酶消化法可從人脂肪組織中獲取間充質(zhì)干細胞，其與骨髓間充質(zhì)干細胞相似，具有很強的增殖分化能力，通過流式細胞技術(shù)檢測到其表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)表面標志。
　　 第二部分、體外誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)千細胞向胰島樣細胞的分化
　　

4、目的：體外誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細胞向胰島樣細胞的分化，探索其誘導(dǎo)條件，為組織工程學(xué)種子細胞的來源及其臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：酶消化法分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細胞，當傳至第4代時用2-巰基乙醇、堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)、表皮生長因子(EGF)和尼克酰胺誘導(dǎo)其向胰島樣細胞的分化。人脂肪間充質(zhì)干細胞分三階段進行誘導(dǎo)，第一階段培養(yǎng)在含1mmol/L的2-巰基乙醇的HG-DMEM培養(yǎng)2天，去除舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗

5、細胞，第二階段培養(yǎng)在含0.2g/LB27、10μg/L堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及10μg/L表皮生長因子(EGF)的HG-DMEM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)6天，去除舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗細胞，第三階段培養(yǎng)在含1mmol/L2-巰基乙醇、0.2g/L B27和10 mmoL/L尼克酰胺高糖無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6天誘導(dǎo)細胞向胰島樣細胞分化。對照組用HG-DMEM培養(yǎng)。相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)；RT PCR法檢測誘導(dǎo)前后nestin

6、、胰島素基因的表達；免疫熒光染色法檢測誘導(dǎo)前后nestin、胰島素的表達；誘導(dǎo)第三階段進行雙硫腙染色鑒定胰島β樣細胞團。
　　 結(jié)果：
　　 1、倒置顯微鏡下顯示未經(jīng)誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細胞呈長梭形貼壁生長，誘導(dǎo)后細胞逐漸變圓，并聚集成團。
　　 2、熒光顯微鏡下觀察到誘導(dǎo)8天的細胞nestin蛋白呈陽性表達，誘導(dǎo)14 d細胞nestin蛋白表達量下降，胰島素蛋白表達呈陽性。
　　 3、RT PCR法檢測到

7、誘導(dǎo)8天的nestin mRNA表達陽性，誘導(dǎo)14天的胰島素mRNA表達陽性，nestin mRNA表達陰性。
　　 4、誘導(dǎo)后的細胞進行雙硫腙染色倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后的細胞呈棕紅色，對照組細胞不著色。
　　 結(jié)論：b-FGF、EGF、尼克酰胺等可誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細胞成胰島樣細胞。
　　 第三部分、脂肪間充質(zhì)干細胞分化為胰島樣細胞的功能研究
　　 目的：脂肪間充質(zhì)干細胞向胰島樣細胞誘導(dǎo)后，檢測誘導(dǎo)后細胞

8、分泌胰島素的功能。
　　 方法：ELIAS檢測誘導(dǎo)后細胞對高糖(50mmol/L葡萄糖)刺激的反應(yīng)及胰島素的分泌，F(xiàn)luo-3/AM染色觀察50mmol/L葡萄糖刺激誘導(dǎo)后細胞內(nèi)Ca2+熒光強度的變化。對照組為25mmol/L的葡萄糖刺激誘導(dǎo)后細胞。
　　 結(jié)果：
　　 1、誘導(dǎo)后細胞經(jīng)50mmol/L葡萄糖刺激后，胰島素的水平明顯增高與對照組比較有顯著差異(p＜0.05)。
　　 2、誘導(dǎo)后細胞經(jīng)Flu