銀杏葉提取物對哮喘大鼠的治療作用及相關機制的研究.pdf

1、目的：通過用銀杏葉提取物(ginkgobiobaextract，Egb761)作用于哮喘大鼠模型，觀察哮喘大鼠氣道上皮細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)及金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase-1，TIMP-1)表達的變化和對氣道形態(tài)學指標的影響，進而探討Egb761對MMP-9及TIMP-1表達的影響和降低氣道炎癥，改善氣道

2、重構的作用，為Egb761治療哮喘提供理論基礎和實驗依據(jù)。 方法：1.實驗動物的分組：健康SPF級SD大鼠60只，雌雄不拘，周齡(4～6周)，體重180±20g，用隨機數(shù)字表法將實驗動物隨機分為5組，每組12只，即正常對照組(A組)，哮喘模型組(B組)，地塞米松組(C組)，Egb761大劑量組(D組)，Egb761小劑量組(E組)。2.哮喘動物模型的復制：用卵蛋白(OVA)100mg和氫氧化鋁200mg加1ml生理鹽水配成10％

3、卵蛋白氫氧化鋁凝膠于模型制作的第1天和第8天，分別給每只大鼠腹腔注射1ml上述混合液。2周后，分組將大鼠置于密閉的有機玻璃箱內(nèi)，每天以1％卵蛋白霧化吸入20分鐘，激發(fā)哮喘2周，共4周。其中A組所有處理用生理鹽水代替，C、D、E組每次霧化前1小時，分別將下述的藥物灌胃2周，C組給予地塞米松1mg/kg/d灌胃，D組給予Egb761200mg/kg/d灌胃，E組給予Egb76150mg/kg/d灌胃，A組和B組則僅給予生理鹽水4ml灌胃。3

4、.取材與染色：末次激發(fā)后24小時內(nèi)用3％戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射后開胸，經(jīng)右心室插管到肺動脈，用含1％的肝素無菌生理鹽水快速沖洗肺血管床。同時，氣管插管至左肺，并用生理鹽水灌洗左側(cè)肺，回收灌洗液并濾去沉渣，將灌洗液離心后，細胞團重懸于1mlPBS液中，并調(diào)整細胞密度為1.0×106/ml，在細胞計數(shù)板上計數(shù)細胞總數(shù)，取已調(diào)整細胞數(shù)的BALF50μl，作細胞涂片，經(jīng)HE染色后在高倍鏡下每張切片計數(shù)200個細胞，并進行細胞分類計數(shù)，

5、計算BALF中各種細胞的百分率。同時，取右肺中葉置于4％的多聚甲醛溶液中固定后，進行脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，片厚為4μm，一部分切片按HE常規(guī)染色步驟染色，另一部分切片作免疫組化處理。4.免疫組化及圖象分析：用免疫組化的方法檢測氣道上皮細胞胞漿中MMP-9及TIMP-1的表達，并用Image-ProPlus圖像分析軟件，測算各組氣道上皮細胞胞漿中MMP-9及TIMP-1的陽性表達產(chǎn)物的平均光密度(0D)值。同時，用計算機病理圖象分

6、析系統(tǒng)測量氣道形態(tài)學參數(shù)值，即細支氣管基底膜周徑(Pbm)、總管壁面積(Wat)、內(nèi)壁面積(Wai)及氣道平滑肌面積(Wam)，并用Pbm將測量值標準化，分別以WAt/Pbm、WAi/Pbm、WAm/Pbm表示相應管壁層的厚度。5.統(tǒng)計學處理方法：所有計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，用SPSS11.5等統(tǒng)計軟件對統(tǒng)計結果進行統(tǒng)計分析。 結果：1.哮喘大鼠的一般情況：用OVA致敏激發(fā)大鼠后發(fā)現(xiàn)哮喘模型大鼠呼吸急促，煩躁不

7、安，腹式呼吸明顯，部分大鼠尚可聞及哮鳴音，呼吸困難，唇爪有不同程度的紫紺；地塞米松組及Egb761大、小劑量組上述癥狀有不同程度的減輕，而正常組大鼠的呼吸、飲食活動及精神狀態(tài)等無明顯異常。2.BALF檢查結果：正常組BALF中偶見炎性細胞和部分脫落的支氣管上皮細胞；哮喘組可見大量的炎性細胞浸潤，尤其以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等浸潤明顯；地塞米松組及Egb761大、小劑量組炎性細胞浸潤較哮喘組明顯減少。炎性細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞及淋巴細胞百

8、分數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計學處理，哮喘組明顯高于正常組、地塞米松組及Egb761大、小劑量組，P＜0.01差異有顯著性；而地塞米松組與Egb761大劑量組比較P＞0.05無統(tǒng)計學差異性；Egb761大劑量組與Egb761小劑量組比較P＜0.01差異有顯著性。3.肺組織病理變化：光鏡下可見正常組支氣管、肺組織結構正常，各級支氣管上皮完整，肺泡間隔正常，無明顯炎性細胞浸潤。而哮喘組大鼠可見其氣道黏膜水腫、黏膜皺襞增多、黏膜下及管周有大量的炎性細胞浸潤、氣

9、道上皮細胞脫落、杯狀細胞增多、細支氣管的氣道壁、平滑肌層及基底膜等明顯增厚、管腔變窄，而地塞米松組及Egb761大、小劑量組較哮喘組有不同程度的減輕，且Egb761大劑量組減輕的程度優(yōu)于小劑量組。4.免疫組化結果：正常組MMP-9及TIMP-1在氣道黏膜上皮細胞胞漿中有少量表達或不表達；哮喘組MMP-9及TIMP-1在氣道黏膜上皮細胞胞漿中呈強陽性表達為棕褐色顆粒，而地塞米松組及Egb761大、小劑量組較哮喘組表達明顯減弱，顏色變淺。各

10、組MMP-9及TIMP-1的平均光密度值經(jīng)統(tǒng)計學處理，哮喘組明顯高于正常組、地塞米松組及Egb761大、小劑量組，P＜0.01差異有顯著性；而地塞米松組與Egb761大劑量組比較P＞0.05無統(tǒng)計學差異性；Egb761大劑量組與Egb761小劑量組比較P＜0.01差異有顯著性。5.氣道形態(tài)學指標比較：與正常組比較，可見哮喘組大鼠氣道壁的總厚度及內(nèi)壁厚度和平滑肌層的厚度均明顯增加，管腔變窄，而地塞米松組及Egb761大、小劑量組較哮喘組有

11、不同程度的減輕。氣道形態(tài)學各指標經(jīng)統(tǒng)計學處理，哮喘組的氣道形態(tài)學指標明顯高于正常組、地塞米松組及Egb761大、小劑量組，P＜0.05有統(tǒng)計學差異性；而地塞米松組與Egb761大劑量組比較P＞0.05無統(tǒng)計學差異性；Egb761大劑量組與Egb761小劑量組比較P＜0.05有統(tǒng)計學差異性。6.相關性分析結果：MMP-9的表達與嗜酸性粒細胞數(shù)呈顯著正相關P＜0.01；TIMP-1與氣道形態(tài)學各指標也呈顯著正相關，P值均小于0.01，有顯著

12、統(tǒng)計學差異性；而MMP-9/TIMP-1的比值與氣道形態(tài)學各指標均呈負相關，P值均小于0.01，有顯著統(tǒng)計學差異性。 結論：1.SD大鼠經(jīng)卵蛋白反復致敏及激發(fā)后可建立理想的哮喘動物模型。2.Egb761對哮喘大鼠氣道上皮細胞的MMP-9及TIMP-1的表達有調(diào)節(jié)作用。3.Egb761對哮喘大鼠的氣道炎癥有明顯改善作用。4.Egb761對哮喘大鼠的氣道重構有干預作用，其調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的表達可能是其機制之一。5.Egb