表皮干細胞構建組織工程皮膚的初步研究.pdf

1、本研究應用Ⅳ型膠原粘附法分選表皮干細胞(ESC)，對分選的細胞進行培養(yǎng)、鑒定，并應用分選的ESC作為種子細胞構建復方殼多糖組織工程皮膚的表皮，為研究ESC的多向分化潛能和分化標志的變化提供良好的實驗模型，并力求獲得生物學性能更佳的組織工程皮膚，為臨床應用提供更理想的生物修復材料。應用基因轉染技術將綠色熒光蛋白(GFP)對種子細胞進行標記，為研究組織工程皮膚種子細胞的生命軌跡和基因修飾打下基礎。 方法：對酶消化分離獲得的表皮細胞，

2、應用Ⅳ型膠原快速粘附法進行分選，并以限制性角質細胞培養(yǎng)基(K-SFM)進行培養(yǎng)，觀察細胞生長狀況及克隆形成情況；選擇ESC相對特異性標記分子β1整合素、角蛋白19(CK19)的單克隆抗體，用免疫組化法對分選后的各組細胞進行鑒定；選擇HMB45、S-100特異表達作為標記物，鑒定分選所得細胞及組織工程皮膚中黑色素細胞(MC)存在及含量；在培養(yǎng)的種子細胞中分別轉染GFP，觀察轉染的成功率，并應用轉染后的細胞構建組織工程皮膚，觀察組織工程皮膚

3、的培養(yǎng)過程中GFP的表達情況；對比研究ESC作為種子細胞與未分選的表皮細胞作為種子細胞構建的組織工程皮膚的組織結構特性的差異。 結果：1.利用對細胞外基質(ECM)的高粘附力，可以初步篩選ESC；所分選的細胞體外培養(yǎng)可形成明顯的克?。?5分鐘組，β1整合素、CK19雙標陽性的細胞占28.50％。 2.Ⅳ型膠原快速粘附法分選的細胞中含有較多的MC，其在K-SFM培養(yǎng)基中可以繼續(xù)生長并增殖，培養(yǎng)14天以后作為種子細胞所構建的

4、組織工程皮膚中仍然含有較多的MC。 3.對種子細胞進行了成功轉染GFP，陽性率較高，構建的組織工程皮膚中仍然可以觀察到GFP的表達。 4.經分選的ESC構建出來的組織工程皮膚，表皮生長較對照組好，表皮顏色較深，組織切片見其表皮層更厚，表皮結構更完善，表皮與真皮的結合更加緊密。 結論：1.Ⅳ型膠原快速粘附法是一種初步分選ESC的較好方法，可以得到含較高比例ESC的增殖活力好的表皮種子細胞；2.分選細胞中存在的MC可