YB-1抑制三氧化二砷誘導的腫瘤細胞自噬及其機制的研究.pdf

1、目的:1.通過轉染SiRNA干擾人YB-1基因的質粒(SiYB-1)和攜帶人YB-1基因的腺病毒表達載體pAdlEasy/YB-1(AdYB-1),探討YB-1與小劑量三氧化二砷(As2O3)誘導的乳腺癌MCF-7細胞及胃癌BGC-823細胞自噬的關系。2.從自噬相關基因Beclin1和Bcl-2調控細胞自噬的機制著手在基因和蛋白水平初步探討YB-1調控自噬的機制。
　　 方法:1.Western-blot方法檢測脂質體轉染Si

2、RNA干擾YB-1和腺病毒轉染pAdlEasy/YB-1過表達YB-1的MCF-7細胞和BGC-823細胞中YB-1蛋白表達的變化。2.4μM/LAs2O3作用于轉染SiYB-1和AdYB-1的MCF-7細胞及BGC-823細胞,運用Western-blot的方法檢測各轉染組細胞中自噬標記蛋白LC3-Ⅱ和p62的表達,MDC自噬特異性染料熒光染色觀察自噬泡的聚集綜合評價YB-1對As2O3誘導的腫瘤細胞自噬的影響。3.實時熒光定量PCR

3、(qRT-PCR)和Western-blot的方法檢測自噬相關基因Beclin1和Bcl-2在MCF-7細胞及BGC-823細胞各轉染組中的mRNA水平和蛋白水平表達情況。4.轉染AdYB-1的MCF-7細胞及BGC-823細胞,用Bcl-2的抑制劑HAl4-1預處理后再用As2O3誘導,Western-blot方法檢測各組中蛋白LC3-Ⅱ、p62和Beclin1的表達,MDC染色觀察自噬泡的聚集。
　　 結果:1.轉染SiYB

4、-1和AdYB-1的MCF-7細胞及BGC-823細胞,經Western-blot方法檢測,與無意干擾組(HK)和空病毒組(AdGFP)相比,兩細胞的SiYB-1組YB-1蛋白表達均明顯降低(P＜0.05),AdYB-1組YB-1蛋白表達均明顯升高(P＜0.05),顯示轉染有效。2.BGC-823細胞和MCF-7細胞各轉染組經4μM/L的As2O3誘導后,Western-blot檢測示AdYB-1能夠抑制低劑量的As2O3誘導的腫瘤細胞

5、內蛋白LC3-Ⅱ的轉化和p62蛋白的降解,MDC染色后顯微鏡觀察,與對照組相比藍色熒光的強度明顯減弱。相反,轉染了SiYB-1的腫瘤細胞與對照組細胞相比,由As2O3誘導的細胞自噬水平進一步增強,自噬標記蛋白檢測示SiYB-1組促進了As2O3誘導的細胞內LC3-Ⅱ蛋白的轉化,p62蛋白的降解也明顯增加,MDC染色可見自噬泡熒光強度增強,熒光顆粒明顯增多。3.BGC-823細胞和MCF-7細胞各轉染組經4μM/L的As2O3誘導后,qR

6、T-PCR檢測顯示,與轉染對照(AdGFP)組相比,AdYB-1組Bcl-2基因相對表達水平增高(P＜0.05);而干擾YB-1表達后,SiYB-1組Bcl-2基因相對表達水平較其轉染對照(HK)組明顯降低(P＜0.05),Beclin1基因表達在各組無統(tǒng)計學差異。Western-blot的方法檢測各轉染組Bcl-2蛋白和Beclin1蛋白,結果顯示與轉染對照組HK和AdGFP組相比,SiYB-1組Bcl-2蛋白表達降低(P＜0.05)

7、,而Beclin1蛋白表達增高(P＜0.05);AdYB-1組Bcl-2蛋白表達增高(P＜0.05),Beclin1蛋白表達降低(P＜0.05)。4.轉染了AdYB-1的BGC-823細胞和MCF-7細胞,加入Bcl-2的抑制劑HA14-1預處理4h后再用As2O3誘導,Western-blot檢測顯示,AdYB-1組Beclin1蛋白表達降低,P62蛋白降解減少,LC3-Ⅱ蛋白減少,在加入HA14-1組Beclin1蛋白恢復表達,P6

8、2降解增加,LC3-Ⅱ升高。提示在Bcl-2的抑制劑HA14-1預處理后,As2O3誘導的自噬不能因轉染AdYB-1而被抑制。
　　 結論:1.在BGC-823細胞和MCF-7細胞中成功轉染SiYB-1和AdYB-1改變YB-1的表達。2.YB-1能夠抑制As2O3誘導的BGC-823細胞和MCF-7細胞的自噬水平。3.YB-1可能通過上調Bcl-2、抑制Beclin1,實現(xiàn)對As2O3誘導的腫瘤細胞自噬的抑制作用,為YB-1參