小鼠骨髓源性樹突狀細胞體外培養(yǎng)的研究.pdf

1、目的:為建立一種簡單、經(jīng)濟的小鼠骨髓源性樹突狀細胞(dendriticcells,DCs)體外培養(yǎng)方法,探討不同濃度小鼠粒/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)對小鼠骨髓源性樹突狀細胞培養(yǎng)的影響,找出培養(yǎng)中適宜的濃度范圍,觀察細胞形態(tài),并通過流式細胞儀分析體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源性樹突狀細胞表型,為基礎研究及臨床應用提供實驗基礎。
　　方法:(1)小鼠骨髓源性樹突狀細胞培養(yǎng):分離bab/c小鼠骨髓細胞,采用沉降

2、法獲得貼壁細胞作為樹突狀細胞的前體細胞,將樹突狀細胞前體共分為分為6組,分別為:第1組:GM-CSF終濃度為5ng/ml,IL-4終濃度為2.5ng/ml,第2組GM-CSF終濃度為10ng/ml,IL-4終濃度為5ng/ml,第3組:GM-CSF終濃度為30ng/ml,IL-4終濃度為15ng/ml,第4組:GM-CSF終濃度為100ng/ml,IL-4終濃度為50ng/ml,第5組:GM-CSF終濃度為200ng/ml,IL-4終濃

3、度為100ng/ml,第6組為空白對照組,培養(yǎng)基中未加入細胞因子,培養(yǎng)7天,收集懸浮及半貼壁細胞。(2)樹突狀細胞形態(tài)學觀察:每天用光學倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察不同濃度組DC形態(tài)學變化,并于第3,5,7天拍攝細胞照片。(3)檢測樹突狀細胞表型:采用流式細胞儀檢測不同濃度細胞因子組細胞表面標志,以小鼠樹突狀細胞的特異性標志CD11c評估所培養(yǎng)的樹突狀細胞純度,評價不同濃度細胞因子在樹突狀細胞體外培養(yǎng)的作用。
　　結果:(1)樹突狀細胞

4、形態(tài)學觀察:每只小鼠可獲得骨髓細胞數(shù)約2.4～3.6×107個,培養(yǎng)第1天,倒置顯微鏡下觀察可見細胞貼壁生長,體積小,多為圓形,第2組及第3組可見細胞集落形成。第3天,各組細胞體積增大,部分細胞呈半懸浮狀態(tài),但第5組細胞數(shù)量減少,可見細胞碎片。第5天時可見1,2,3,4組懸浮細胞增多,部分細胞可見棘突,培養(yǎng)至第7天,第1、2、3、4組細胞集落分散,大量細胞懸浮,細胞表面可見多個突起,為iDC,而第5組細胞稀疏,部分出現(xiàn)空泡,無典型DCs

5、。(2)小鼠樹突狀細胞培養(yǎng)中適宜的GM-CSF及IL-4濃度范圍:分別為5ng/ml~100ng/ml、2.5ng/ml~50ng/ml,在該濃度范圍中,低濃度與高濃度細胞因子誘導培養(yǎng)出的iDC數(shù)量及純度上無明顯差別。
　　結論:(1)利用GM-CSF及IL-4可誘導小鼠骨髓細胞分化為樹突狀細胞,每只小鼠約可獲得樹突狀細胞2.0×107個,并且樹突狀細胞純度在90％以上,完全可滿足實驗需要。(2)應用低濃度的GM-CSF及IL-4