卵轉(zhuǎn)鐵蛋白誘導HT--29結(jié)腸癌細胞凋亡的研究.pdf

1、近年來，越來越多的研究證據(jù)表明雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin，OTF)具有抗腫瘤活性，分析研究OTF抑制細胞生長的作用以及凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白的表達來揭示其誘導癌細胞凋亡的作用具有十分重要的理論意義。
　　本課題利用醇析法并結(jié)合兩步離子交換法純化得到OTF（純度＞96.65％），并用純化的天然OTF干預HT-29結(jié)腸癌細胞的生長;顯微鏡觀察和MTT法檢測細胞的生長狀況和細胞生長率;AnnexinⅤ-EGFP與PI雙染法檢

2、測細胞凋亡率以及JC-1染色法測定細胞線粒體膜電位;最后利用蛋白質(zhì)免疫印跡法測定線粒體途徑和死亡受體途徑中的關(guān)鍵蛋白Caspase3、Bcl-2、Bax、FADD、Caspase8以及Bid的表達，研究OTF誘導HT-29結(jié)腸癌細胞凋亡的作用以及誘導凋亡的途徑。
　　卵轉(zhuǎn)鐵蛋白在濃度范圍為10mg/mL、30 mg/mL、50 mg/mL、70 mg/mL內(nèi)對于HT-29細胞具有抑制生長的影響，且隨著干預濃度的增大，細胞逐漸與周圍

3、細胞脫離并呈單個生長、貼壁性變差、細胞逐漸變小且形態(tài)逐漸干癟、顏色昏暗無光澤，尤其是70mg/mL的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白干預細胞后，細胞數(shù)量明顯減少，可能是由于細胞死亡后不再貼壁生長。10mg/mL、30 mg/mL、50 mg/mL、70 mg/mL濃度范圍內(nèi)的OTF對細胞生長率均有所抑制，且隨著干預濃度的增加，OTF對HT-29細胞生長的抑制作用不斷增強，具有很明顯的濃度依賴性;同時隨著OTF干預時間的增加(24h、36h、48h、60h)細

4、胞生長率也逐漸下降。OTF具有抑制HT-29細胞生長的作用可能與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白具有誘導細胞凋亡的能力有關(guān)。而OTF在濃度范圍為10mg/mL、30 mg/mL、50mg/mL、70 mg/mL內(nèi)對于細胞凋亡率的影響的表明:隨著OTF干預濃度和干預時間的增加，HT-29細胞凋亡率逐漸升高，尤其是濃度為50mg/mL和70mg/mL的OTF干預細胞后，凋亡率隨著干預時間的增加（24h至60h）顯示出更加顯著的變化:50mg/mL組細胞凋亡率由1

5、506％上升至6993％，70mg/mL組細胞凋亡率由15.28％上升至84.43％。濃度范圍在10mg/mL、30 mg/mL、50 mg/mL、70 mg/mL的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分別干預HT-29細胞12h、18h和24h后，線粒體膜電位顯著下降，且具有明顯的濃度依賴性，但隨著干預時間的增加這種下降趨勢逐漸變緩，表明OTF可以誘導HT-29細胞凋亡并且可能與線粒體途徑有關(guān)，但隨著干預時間的增加使細胞由凋亡早期階段逐漸進入凋亡晚期階段。

6、r>　　卵轉(zhuǎn)鐵蛋白可以激活處于凋亡通路下游位置的Caspase3，說明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白誘導HT-29細胞凋亡是通過Caspase依賴性途徑進行的，而線粒體途徑中的Bcl-2蛋白的表達量隨著卵轉(zhuǎn)鐵蛋白干預濃度的升高不斷減少，Bax蛋白表達量隨著卵轉(zhuǎn)鐵蛋白干預濃度的升高不斷增加，表明促凋亡因子Bax與抗凋亡因子Bcl-2均被激活，即卵轉(zhuǎn)鐵蛋白誘導HT-29細胞后激活了線粒體途徑，并使下游Caspase3活化，從而引起細胞凋亡。在死亡受體途徑中，連