共表達EGFP與布魯氏菌P39基因逆轉錄病毒載體的構建.pdf

1、目的：本研究主要目的是構建表達羊型布魯氏菌M5株P39基因的逆轉錄病毒載體，為研發(fā)新型布魯氏菌DNA疫苗奠定實驗基礎。 方法：1．目的基因的獲取：對主要在我國流行以及對人致病性最高的羊型布魯氏菌M5株擴增培養(yǎng)，并提取全基因組。根據Genbank中已公布的基因組序列選擇已知的免疫原性高、主要誘導細胞介導免疫應答(cell-mediated immunity，CMI)的蛋白編碼基因(P39基因)，設計特異性引物利用PCR擴增目的基因

2、片段。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，將P39基因與克隆載體pMD19-T載體連接并轉化感受態(tài)E．coli DH5α，經藍白篩選得到連接正確的重組質粒，將其命名為pMD19-T-P39質粒，并應用酶切、PCR以及基因測序等方法對其進行鑒定。2．共表達P39和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因逆轉錄病毒載體的構建：對上述得到的重組質粒pMD19-T-P39進行酶切后，將目的基因P39插入到攜帶EGFP基因的逆轉錄病毒載體pRev-IRES2-

3、EGFP載體的多克隆位點(MCS)中。構建的逆轉錄病毒載體經限制性內切酶鑒定后，采用脂質體(Lipofectin)介導方法轉染包裝細胞(PT67)，經G418篩選后將得到的陽性克隆進行培養(yǎng)擴增。用收獲的培養(yǎng)上清液感染鑒定細胞(NIH-3T3)測定每毫升病毒液中感染性病毒顆粒的數量。此時，包裝細胞產生的假病毒即可作為攜帶羊型布魯氏菌特異性抗原基因P39的DNA疫苗。 結果：通過PCR方法成功地獲得了目的基因P39，并將其構建到克隆