融合蛋白TAT-XIAP的原核表達及其生物學活性的初步鑒定.pdf

1、目的:體外合成X連鎖調亡抑制蛋白(XIAP)基因編碼區(qū)序列,將其插入空載體pTAT-HA質粒,構建pTAT-XIAP原核表達載體,獲得高產量、高純度的TAT-XIAP目的蛋白,蛋白復性后并研究融合蛋白TAT-XIAP的生物學活性。
　　方法:體外合成大鼠 XIAP基因編碼區(qū)序列,將其插入 pTAT-HA質粒,構建重組表達載體pTAT-XIAP,Nco I和 Xho I酶對 pTAT-XIAP質粒 DNA進行雙酶切并測序無誤后,將

2、pTAT-XIAP重組表達載體轉入大腸埃希氏菌(E.coli)表達菌株 BL21plysS。隨機挑取陽性克隆的單菌落,接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜,當OD600=0.8-1時,加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1mM,誘導4h,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示目的蛋白主要以包涵體的形式存在。進一步優(yōu)化表達條件,SDS-PAGE及蛋白印跡法(western blot)鑒定目的蛋白TAT-

3、XIAP的表達形式。取TAT-XIAP包涵體蛋白溶解于8M尿素4℃過夜,離心取上清加入鎳離子親和層析柱(Ni2+-NTA),在變性的條件下,用20mM和50mM咪唑溶液各15mL進行洗脫,100mM咪唑溶液收集純化的TAT-XIAP目的蛋白。SDS-PAGE鑒定該蛋白的純化效果。將純化后的TAT-XIAP蛋白、10％甘油和0.014mol/L的β-巰基乙醇裝入透析袋,依次用6M、5M、4M、2M、1M尿素緩沖液和PBS4℃磁力攪拌進行透

4、析,獲得了復性的TAT-XIAP融合蛋白。取CEN2對數(shù)生長期的細胞,不同濃度的融合蛋白TAT-XIAP作用不同時間,MTT法檢測TAT-XIAP融合蛋白對CEN2細胞生長的影響。SD大鼠腹腔注射復性后的TAT-XIAP融合蛋白,于注射12h后斷頭取大腦組織,冰凍切片,厚約6μm,免疫熒光顯微鏡下觀察TAT-XIAP融合蛋白在腦組織的分布情況。
　　結果:1.1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示pTAT-XIAP質粒DNA約4.5kb,pT

5、AT-HA質粒DNA約3kb。pTAT-XIAP質粒DNA經NcoI/XhoI酶切鑒定,電泳結果顯示在Marker約3kb處可見空載體 pTAT-HA的條帶,在 Marker約1.5kb處可見 XIAP的條帶。2.12%SDS-PAGE結果顯示TAT-XIAP目的蛋白分子量約64kD,該蛋白主要以包涵體的形式存在,經調整誘導溫度、IPTG濃度及誘導時間等進一步優(yōu)化誘導條件,發(fā)現(xiàn) TAT-XIAP目的蛋白仍主要以包涵體的形式存在。TAT-

6、XIAP目的蛋白在變性條件下經鎳離子親和層析柱純化,獲得了高產量、高純度的 TAT-XIAP目的蛋白。TAT-XIAP融合蛋白經 SDS-PAGE和western blot分析,在分子量約64kD處有一明顯表達條帶,實驗結果與理論結果相符。3.蛋白復性后,MTT法檢測TAT-XIAP融合蛋白對CEN2細胞生長的影響,數(shù)據(jù)經統(tǒng)計學分析后,結果顯示TAT-XIAP融合蛋白對CEN2細胞的生長有促進作用。4.免疫熒光結果顯示SD大鼠腦組織中有

7、大量綠色熒光信號,其中以大腦皮質、基底節(jié)處多見。該蛋白主要分布在細胞漿中。PBS對照組除非特異性著色外,未見明顯陽性綠色熒光信號。
　　結論:1.成功構建 pTAT-XIAP原核表達載體并表達出目的蛋白。2.重組蛋白 TAT-XIAP經鎳離子親和層析純化,獲得了高產量、高純度的目的蛋白。3.重組蛋白TAT-XIAP復性成功,動物實驗證實該蛋白可成功穿透血腦屏障,MTT法檢測發(fā)現(xiàn)TAT-XIAP融合蛋白對CEN2細胞生長有促進作用,