嵌合動脈炎病毒全長cDNA克隆的構建及應用.pdf

1、除馬動脈炎病毒(equine arteritis virus，EAV)外，動脈炎病毒科還包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、乳酸脫氫酶升高癥病毒(lactate dehydrogenase elevating virus，LDV)以及猴出血熱病毒(simian hemmorrhagic fever virus，SHFV)。動脈炎

2、病毒感染的宿主主要為馬和驢(EAV)、豬(PRRSV)、鼠(LDV)和非洲、亞洲一些種屬的猴(SHFV)。感染動物主要表現(xiàn)為無明顯臨床癥狀的持續(xù)性帶毒；另外，也可造成流產或致死性的出血性高熱。關于動脈炎病毒基因組RNA的復制、亞基因組mRNA的轉錄和翻譯、病毒顆粒組裝以及病毒致病機理等許多問題尚待研究。 本研究旨在通過建立EAV全長cDNA克隆，進而通過構建不同EAV或其它動脈炎病毒之間的嵌合cDNA克隆，進而研究不同基因組區(qū)域

3、及其編碼產物在病毒復制過程中的作用，為進一步剖析病毒遺傳組份的結構與功能及其在致病機理奠定基礎。 1、馬動脈炎病毒基因組全長cDNA克隆的構建及其序列分析 根據(jù)馬動脈炎病毒Bucyrus株全基因組序列(GenBank NO NC 002532)，設計并合成EAV特異引物，進而應用RT-PCR技術分6段擴增了EAV M9544株的全基因組cDNA。將擴增的各個cDNA重疊片斷PE124、PE631、PE1854、PE519

4、1、PE61107、PE97Q分別克隆到載體pCR-Blunt Ⅱ-TOPO中，建立了EAV各擴增片段的cDNA克隆。在擴增5'末端時，引NotI酶切位點和T7啟動子序列；在基因組3'末段Poly(A)尾后引入XhoI酶切位點，后者供cDNA模板的線性化之用。將上述片斷在pCR BluntⅡ-TOPO中依次連接，最后克隆到質粒pBluescript Ⅱ SK(+)中，獲得了EAV全長基因組cDNA克隆pWEAV。核酸序列分析表明：該毒株

5、基因組全長為12704個核苷酸(不包括poly(A)尾)，與EAV北美譜系代表株Bucyrus株的同源性為99.1％：與歐洲譜系分離株同源性為85.5％。與Bucyrus株全長序列相比，M9544株EAV全長基因組中共有106個核苷酸變異，有兩個核苷酸位于5'UTR中，在編碼區(qū)中有68個核苷酸為沉默突變，另外的36個核苷酸相應地導致編碼區(qū)內36個氨基酸發(fā)生變異。本研究構建了EAV M9544株基因組全長cDNA克隆pWEAV，為進一步獲

6、取EAV感染性克隆并研究動脈炎病毒基因組結構和功能奠定了基礎。 2 動脈炎病毒復制過程結構蛋白調控因子的初步研究 動脈炎病毒的基因組RNA復制、亞基因組mRNA轉錄和翻譯、病毒顆粒包裝等病毒生命周期的調控機制，尤其是病毒編碼蛋白在其中所起的作用尚待進一步研究。將所構建的M9544株全長cDNA克隆pWEAV體外合成RNA后轉染BHK-21細胞，通過免疫熒光和RT-PCR方法檢測轉染細胞及培養(yǎng)上清，結果均不能檢測到病毒的復

7、制、轉錄和細胞病變(CPE)，說明pWEAV含有致死性變異位點。 為了查明pWEAV中關乎病毒復制調控的致死性變異位點，本研究將細胞適應株感染性克隆pEAV030(Snijder博士提供)為骨架，將pWEAV基因組不同區(qū)域cDNA片段置換嵌合到pEAV030中，構建了一系列pEAV030/pWEAV的嵌合cDNA克隆。 將后者體外轉錄RNA后轉染BHK-21，病毒拯救試驗表明，上文所提及106個變異核苜酸中，位于5'UT

8、R中的兩個核苷酸變異不影響病毒的感染性； 在ORF1編碼的非結構蛋白中共有10個氨基酸的變異和ORF2-4編碼的結構蛋白GP2-4中11個氨基酸變異也不影響病毒的感染性。 另一方面，發(fā)現(xiàn)在pWEAV克隆基因組片段1651nt-4264nt間(nsp2的N端年和nsp3 C端)的6個氨基酸中存在致死性變異位點。nsp2和nsp3中這些氨基酸變異影響了病毒基因組RNA復制和亞基因組RNA轉錄。而下游嵌合克隆pEAVexb(以

9、pWEAV相應序列替換pEAV030的11488nt-11901nt)能夠在BHK-21中進行復制轉錄，但是在轉染細胞以及多次傳代細胞中未出現(xiàn)CPE。 說明GP5中位點170 A→S氨基酸突變影響病毒復制的轉錄后(post-transcriptional)階段，可能阻斷了病毒顆粒組裝以及出芽等病毒復制步驟。在pEAVxx(以pWEAV相應序列替換pEAV030的11948nt-12704nt)N蛋白位點56 H→Y位點為病毒感染

10、性致死性變異位點；通過對pEAVxx進行回復突變(Y→H)獲得了拯救病毒，說明該氨基酸對病毒轉錄后的翻譯、病毒顆粒包裝或出芽等步驟可能起調控作用。 總之，通過利用無感染性的M9544株與感染性克隆pEAV030進行嵌合，我們發(fā)現(xiàn)了28個氨基酸變異不影響EAV的復制過程：而另一方面，nsp2的N端和nsp3C端中6個氨基酸變異影響病毒基因組RNA復制和亞基因組RNA轉錄過程。而GP5和N蛋白中兩個位點對病毒基因轉錄后階段起著重要的

11、調控作用。 3、Nsp6在動脈炎病毒復制中的作用 動脈炎病毒的非結構蛋白(nsp1-13)裝配成所謂的“復制轉錄酶復合體”(Replicase/Trsllscriptiase Complex，RTC)，后者是動脈炎病毒基因組RNA復制及亞基因組mRNA轉錄等過程的引擎。目前對各個nsp在RTC中所起的作用及機制并不清楚，其中，nsp6作為已知最小的nsp(13-22aa)，其結構和功能有待研究。為了研究nsp6在動脈炎病

12、毒復制中的作用，本研究通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)法對PRRSV全長感染性克隆pAPRRS的nsp6(16aa)進行了系列缺失，同時與其它動脈炎病毒的nsp6進行替換，構建了一系列以pAPPRS為骨架的全長cDNA克隆突變體。病毒拯救試驗表明，nsp6全部(16)或部分(3、6個)氨基酸缺失的突變體不能產生病毒，但RT-PCR結果顯示突變體能夠進行亞基因組的轉錄，說明nsp6對病毒的轉錄是非必需的。歐洲型PRRSV nsp6和p

13、APRRS的nsp6之間存在3個氨基酸差異，用前者替換的嵌合克隆能夠被拯救出相應的嵌合病毒，說明上述三個氨基酸序列不具有型間特異性；將LDV nsp6替換pAPRRS nsp6，改變了nsp6中的6個氨基酸，RT-PCR和IFA能夠檢測到嵌合克隆基因組RNA和亞基因組RNA的復制和轉錄，但是不能產生CPE。 EAV nsp6(22aa)替換pAPRRS nsp6后改變整個APRRS nsp6的結構，嵌合克隆未被檢測到復制和轉錄。

14、 綜上所述，本研究表明，nsp6對動脈炎病毒的感染性是必需的，其作用機制尚待研究；另一方面，我們發(fā)現(xiàn)其中三個氨基酸變異不影響了病毒復制過程，而更大幅度的突變在更大程度上影響了病毒的復制過程，RNA合成翻譯甚或病毒顆粒成熟過程。 4、強弱毒株PRRSV嵌合感染性克隆的構建及鑒定 PRRSV是近兩年來流行于我國大部分省份的“豬高熱綜合征”的主要病原體。該病毒在增殖過程中極易發(fā)生遺傳及抗原變異。查明PRRSV致病性大幅增高的

15、機制，進而研制用于防治易變的流行PRRSV變異株的高效疫苗無疑是獸醫(yī)工作者的當務之急。在弱毒株APRRS的全長感染性克隆pAPRRS及其含有多克隆位點(PacI，SwaI，AscI)的突變感染性克隆pCSA以及我室構建的高致病(high pathogencity，HP)PRRSV感染性克隆pJX143的基礎上，構建了一系列包括PRRSV ORF1a、ORF1b以及ORF2-7等的強弱毒PRRSV嵌合感染性克隆。將構建的嵌合克隆轉染Mar