水稻ABP cDNA克隆、原核表達及RNA沉默載體構建.pdf

1、高等植物中普遍存在的生長素吲哚乙酸(IAA)，對植物的生長發(fā)育(如植株形態(tài)、器官分化、種子形成等)起著重要的調節(jié)作用。生長素結合蛋白(auxin-bindingprotein，ABP)是生長素調節(jié)過程中信號傳導的先驅，它與生長素一起調節(jié)植物的生長發(fā)育過程，在細胞中的含量水平既關系到細胞的相對生長，又直接影響細胞對生長素的敏感性。 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是重要的模式植物之一，深入研究水稻ABP基因的功能及其調控方式并

2、獲得突變材料將為水稻遺傳改良打下堅實基礎。本研究以粳稻同本晴幼苗的RNA為材料，用RACE及重組PCR技術克隆ABP全長cDNA，并對其序列進行了生物信息學分析和預測。同時，利用獲得的ABP進行了原核表達載體構建及RNA沉默載體構建、表達研究等，為獲得水稻產量、品質和抗性方面的突變材料作了一些探索性的工作。主要研究結果如下： 1、克隆了水稻ABP全長cDNA，測序結果已登錄到GenBank，登錄號為EU595028。該cDNA全

3、長920bp(polyA除外)編碼206個氨基酸。含有GAGA轉錄順式作用元件、核糖體結合位點(RBS)、polyA加尾信號、糖皮質激素作用位點等轉錄因子作用位點。序列分析顯示所得核苷酸序列與玉米生長素結合蛋白基因(zm-ABP1)的核苷酸序列同源性達79％，氨基酸序列同源性達78％，同樣具有3個氨基酸保守結構域，C端內質網識別信號KDEL，和1個糖基化位點(NSTF)，表明此基因在不同物種間保守性較高?？缒ゎA測分析顯示，水稻ABP在1

4、-44號氨基酸信號肽部分存在跨膜區(qū)。因此，推測水稻ABP可能是一種大量存在于內質網的分泌型蛋白，且位于質膜進行信號傳導時與其它蛋白錨定。二級結構與三級結構預測顯示，其功能結構域主要集中于β-片層結構區(qū)域，該區(qū)域與ABP的生物學功能關系密切，預測綜合分析顯示可形成有效結合生長素的區(qū)域。 2、分別構建包含水稻ABP全長cDNA和編碼框的原核表達載體，以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為蛋白表達系統(tǒng)嘗試進行了GST融合表達，以獲得

5、純化的水稻ABP進行生化、免疫和蛋白質相互作用方面的研究。但經誘導時間和誘導劑濃度梯度多次篩選，并未觀察到與陰性對照有差異條帶，因此可初步認為水稻ABP表達的條件特殊，不能在此原核表達系統(tǒng)中有效表達或者水稻ABP對大腸桿菌的生長不利導致不能有效表達。 3、為了能用外界誘導因素調控植物體內的RNA沉默，用來自擬南芥的HSP18.2熱激啟動子構建熱激誘導型真核表達載體pCAMBIAl101-HSP，并通過GUS基因的表達證明此表達載

6、體能在熱激條件下有效表達水稻愈傷組織中的外源基因。根據水稻ABPcDNA序列和水稻基因組序列的比對結果，確定了水稻ABP基因的外顯子和內含子的位置關系，通過引物設計和重組PCR方法得到以水稻ABP基因內含子為莖環(huán)結構，外顯子為反向互補序列的DNA發(fā)央結構片段。在此基礎上構建了熱激誘導型的RNA沉默載體pCAMBIA1301-HSP-ABP并轉化水稻愈傷組織以獲得水稻ABP基因誘導型缺陷突變材料。轉化后的材料死亡，推測存在可能因ABP缺損