P-ezrin通過p38MAPK信號通路介導乳腺癌轉移.pdf

1、埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(Ezrin-Radixin-Moesin，ERM)蛋白家族通過組成膜細胞骨架相關復合體和特殊膜結構對細胞活動進行調節(jié)，在腫瘤的侵襲轉移中起了重要的作用。細胞骨架連接蛋白ezrin屬于ERM家族成員之一，定位于6q25.2-6q26編碼基因為villin2。新近研究發(fā)現ezrin高表達與多種惡性腫瘤的侵襲轉移呈正相關。細胞內ezrin通過N端與C端相互作用，形成頭尾連接的折疊狀態(tài)遮蔽了分子表面的結合位點，處于失

2、活狀態(tài)。Fievet等發(fā)現Thr567磷酸化和PIP2共同參與ezrin活化，活化的ezrin通過連接F-肌動蛋白絲與胞膜的CD44，E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)，細胞間黏附分子1/2(Intercellular adhesion molecule1/2，ICAM1/2)等發(fā)揮功能。 探討ezrin上下游調控分子，這些與調控有關的分子將會成為治療腫瘤轉移的關鍵。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated P

3、rotein Kinase，MAPK)是細胞的主要信號傳導系統(tǒng)之一，p38MAPK屬于MAPK的一個亞族，它通過磷酸化作用改變下游因子的表達，參與多種胞內信息傳遞過程。多種生長因子、炎癥因子和應激反應可激活p38MAPK，p38MAPK激活后可使多種轉錄因子活化，影響基因轉錄、蛋白合成，細胞能動性和細胞骨架結構改變，在細胞侵襲、轉移方面具有重要的調控功能。綜上p38和ezrin只有都磷酸化后才能行使后續(xù)功能，目前關于p-p38，p-ez

4、rin兩者在介導乳腺癌轉移方面的研究，國內外鮮有報道。 Mengdong Lan等研究發(fā)現小鼠永生性肝細胞系中ezrin蛋白通p38MAPK信號通路的磷酸化參與微絨毛的形成，這說明p38與ezrin可能存在著一定的聯系，但是作者認為：1：轉染raf-1基因的小鼠肝細胞中snail表達上調E-caherin，ezrin表達下調，微絨毛縮短，小鼠肝細胞發(fā)生上皮間質轉，細胞間黏附變弱而易發(fā)生轉移。2：加入p38抑制劑SB203580

5、后，ezrin，p-ezrin，E-cadherin表達上調，微絨毛變長變粗，而snail表達下調，不易發(fā)生轉移。然而我們認為：p38MAPK信號通路可能參與ezrin C端(Thr567)的磷酸化，使p-ezrin上調，微絨毛變長變粗，從而增強腫瘤的侵襲轉移能力。為此本實驗在回顧乳腺癌中p-ezrin和p-p38表達的基礎上，著重研究兩者在乳腺癌細胞系中的關系。探討p38MAPK通路是否參與ezrin C端(Thr567)的磷酸化，影

6、響p-ezrin蛋白表達，微絨毛的形成。為乳腺癌復發(fā)轉移的治療提供新的理論依據。 材料和方法： 1、材料 (1)臨床資料80例乳腺癌組織，取自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2001年1月至2007年5月手術切除標本。所有患者術前未經任何治療。80例均為乳腺浸潤性導管癌(IDC)，TNM分期Ⅰ-Ⅱ期51例，Ⅲ-Ⅳ期29例。有淋巴結轉移33例；收集50例外科手術切除新鮮乳腺組織標本，標本取出后立即置-70℃冰凍保存。其中

7、30例為IDC，有淋巴結轉移為13例，20例為乳腺纖維腺瘤。 (2)細胞系三種人乳腺細胞系(MCF-10A為乳腺正常上皮細胞系，MCF-7為低侵襲低轉移癌細胞系，MDA-MB-435s為高侵襲高轉移癌細胞系)原購自北京協和基礎醫(yī)學院細胞中心，本實驗由中國醫(yī)科大學已有的細胞復蘇而得。 (3)主要試劑抗人p-p38單克隆抗體(＃9216)和兔抗人p-ezrin單克隆抗體(＃3149)購自Cell signaling公司。p3

8、8MAPK特異性抑制劑SB203580(＃559398)購自美國Calbiochem公司，于-20℃保存待用。異硫氰四甲基羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽(TRITC-Phalloidin)購自Sigma公司，Transwell小室(孔徑8um)購自Coming公司。 2、方法 (1)免疫組織化學技術80例標本經10％中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法(Streptavidin-p

9、eroxidase，S-P)按說明書行免疫組化染色。p-p38稀釋比例為1:200，p-ezrin稀釋比例為1:50；以PBS代替-抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌切片作陽性對照。 (2) Westem blot技術總蛋白從組織、生長到對數期收集的細胞及不同濃度的SB203580(0、5、10、20umol/L)處理24小時后的435s細胞中提取。用Bradford法測定蛋白濃度。取等量蛋白，進行SDS-PAGE和轉印，分別孵育一

10、抗(p-p381:400，p-ezrin1:400稀釋)4℃過夜，相應二抗(1:4000)37℃孵育，ECL發(fā)光，拍照。用表達p-p38的PVDF膜剝脫后重新孵育獲得β-actin抗體作為內參。 (3)細胞免疫熒光染色取對數生長435s細胞，接種到24孔板中，4％多聚甲醛固定30min，1％TritonX-100增加細胞膜的通透性，BSA封閉后，分別加入一抗p-p38(1:100)，p-ezrin(1:100)，4℃過夜，避光加

11、入相應FITC標記二抗(1:50)，同時加入異硫氰四甲基羅丹明(TRITC)標記的鬼筆環(huán)肽(1:50)，30分鐘后，避光加入Hoechest(1:100)37℃復染細胞核。熒光顯微鏡(BX60，OLYMPUS)觀察成像。 (4)掃描電鏡取對數生長細胞，消化后接種到蓋玻片上，用不同濃度的SB203580(0、5、10、20umol/L)處理435s，24小時后，加2％戊二醛+2％甲醛固定24小時，1％鋨酸固定1.5小時，梯度酒精脫

12、水，醋酸異戊酯置換，CO2臨界點干燥，真金噴鍍，掃描電鏡(日本JEOL SEM-T300)觀察并攝片。 (5) Transwell上室加入1:6Matrigel膠制成的人工基底膜后接種總體積200ul435s細胞，并加入終濃度分別為0、5、10、20umol/LSB203580。每個藥物濃度做3復孔，37℃培養(yǎng)24h后觀察。擦掉基底膜上室面的細胞，下室細胞固定后Giemsa染色。400×光鏡下隨機選擇30個視野計數，取其平均數為

13、穿膜細胞數。 3、統(tǒng)計學分析 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行數據處理：采用X2檢驗(不滿條件時用Fisher確切概率法)分析各組計數資料，采用Spearman等級相關分析p-p38蛋白與p-ezrin蛋白表達的關系，采用t檢驗分析Westem blot圖像灰度值，transwell穿膜細胞數，用LSD-t檢驗對各樣本均數行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果： 1、p-p38、p-ezrin在

14、乳腺癌組織中的表達及其同臨床病理關系 (1)免疫組化結果顯示：p-p38在80例IDC組織中陽性表達49例(61.3％)，主要定位于細胞核，少量定位于細胞漿。p-ezrin陽性表達34例(42.5％)，定位于細胞膜，少量定位于細胞漿。統(tǒng)計學分析顯示，p-p38蛋白表達和p-ezrin蛋白表達呈正相關(r=0.269，P=0.016)。兩者表達水平均與IDC的TNM分期(P=0.012，P=0.002)、淋巴結轉移情況(P=0.0

15、15，P=0.001)相關，而與患者年齡(P=0.580，P=0.670)，腫瘤大小(P=0.107，P=0.142)無明顯相關性。 (2) Western blot結果顯示：參照DNA分子量標準，可見在43，80KD附近有特異性條帶，對應位置分別為p-p38，p-EzrinThr(567)/Radixin(Thr564)，統(tǒng)計結果顯示：p-p38，p-ezrin在IDC中的表達高于乳腺纖維腺瘤組(P=0.015，P=0.000

16、)，兩者的表達水平在Ⅲ-Ⅳ期IDC中高于Ⅰ-Ⅱ期(P=0.023，P=0.000)；在有淋巴結轉移的乳腺癌中高于無淋巴結轉移患者(P=0.028，P=0.002)；而與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關性(P=0.7881，P=0.773；P=0.739，P=0.895)。 2、p-p38、p-ezrin在乳腺細胞系中的表達 (1)Western blot檢測，乳腺正常上皮細胞系10A和乳腺癌細胞系MCF-7，435s中兩種

17、蛋白表達水平呈遞增趨勢。 (2)選取兩種蛋白均高表達的高侵襲高轉移435s細胞系，熒光定位顯示：p-p38在胞核中強表達，在胞漿中僅有少量的表達；p-ezrin在胞漿和胞膜上彌散表達，均顯示綠色熒光；F-actin在胞漿和胞膜上表達，呈紅色，雙色熒光分析顯示p-ezrin和F-actin在同一細胞內共位表達。 3、p38MAPK信號通路特異性阻斷劑SB203580作用MDA-MB-435s細胞系24h后觀察各指標改變