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文檔簡介
1、背景及目的:結核?。═B)是我們?nèi)祟愐阎淖罟爬系膫魅静≈?,結核分枝桿菌(M.tb)是主要致病因素,所以尋找有效的抗 M.tb藥物或者疫苗一直是各國研究的重點之一。但是,至今其預防和治療仍不盡人意。雖然,現(xiàn)有的商業(yè)疫苗已經(jīng)有了卡介苗(BCG),其對于兒童感染的 TB預防是有效的,尤其是較嚴重類型TB(如結核性腦膜炎、粟粒性結核病),但是其對保護成人肺結核方面缺乏穩(wěn)定性。目前對M.tb的研究主要是運用M.tb的不同成分或者其自身分泌蛋白
2、作為抗原,誘導不同的免疫細胞(γδT細胞、CD3+細胞等)發(fā)生反應,從而深入探究相關機制,以便于研制出新的疫苗或者抗TB藥物。M.tb的胞壁中的含有大量的脂類成分,它們就像一層厚厚的保護莢膜,既可以抵抗不利環(huán)境的侵害,也具有免疫調(diào)節(jié)作用,特別是在宿主固有免疫和適應性免疫應答的誘導中均扮演重要的角色,所以這提示M.tb的脂類成分可以成為重要的抗M.tb疫苗或者藥物研究的靶點。本實驗首先觀察,在體外培養(yǎng)結核桿菌裂解物刺激人外周血單個核細胞(
3、PBMC)的實驗中,將胎牛血清(FBS)和人AB型血清作為培養(yǎng)液添加劑的效果比較。其次觀察,我們挑選的一些脂類抗原對人外周血中PBMC活化和增殖的作用,進而探討脂類抗原在結核感染中是否存在特異性免疫作用。
方法:(1)抽取健康成人外周血,分別加入結核桿菌全菌裂解物(WCL)或者同時給予人重組白細胞介素-2(rhIL—2)和植物血凝素(PHA),同時設置空白對照組,之后分別在含10%人AB型血清的RPMI1640培養(yǎng)液和10%F
4、BS的RPMIl640培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天后,用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)結果,運用流式細胞儀(FCM)檢測淋巴細胞增殖情況。(2)運用FCM和酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT)分別檢測,從PBMC中分里出來的粘附細胞被IL-4和GM-CSF誘導培養(yǎng)前后的表面抗原(CD11c,CD14,CD83)的表達,同時再檢測已經(jīng)被誘導培養(yǎng)成非成熟的樹突狀細胞(imDCs)且被下列抗原WCL,全脂質(TLIP),丙酮可溶性脂質(ASLIP),純硫脂(PSLIP
5、),脂阿拉伯糖(LAM),LM,培養(yǎng)液分泌蛋白(CFP),結核桿菌耐熱抗原(M.tb-HAg),磷酸脂多糖(LPS)和空白對照組刺激培養(yǎng)后的細胞表面抗原(CD83)表達和IL-12分泌情況。(3)運用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)分別檢測,非粘附的PBMC(預先被CFSE標記過)加入到抗原已經(jīng)刺激過的imDCs后,共同培養(yǎng)3天后用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測各組培養(yǎng)上清液內(nèi)TNF-α的濃度。當培養(yǎng)到第9天,運用FCM檢測各組P
6、BMC的T細胞亞群(CD3,CD4,CD8,NKT和γδT)增殖和分泌IL-4,TNF-α和IFN-γ的情況。
結果:(1)添加人AB型血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,M.tb WCL對淋巴細胞增殖效果較同樣條件下添加FBS培養(yǎng)的增殖效果明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)用IL-4和GM-CSF誘導培養(yǎng)后的粘附細胞表面CD11c,CD14的比例相較于培養(yǎng)前的比例明顯下降,而表達CD1a的細胞比例則明顯上升,差異有統(tǒng)計學意義(
7、P<0.05)。(3)所有抗原在刺激imDCs后的成熟度標記CD83的比例相較于空白對照組均有明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(4)除了ASLIP組外,其它抗原在刺激imDCs后,其分泌的IL-12的細胞數(shù)量相較于空白對照組均明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(5)除了ASLIP和LM外,其它各抗原均能導致混合后的PBMC在培養(yǎng)3天后分泌TNF-α的濃度相較于空白對照組升高,而LM卻能導致PBMC分泌TNF-α的濃
8、度相較于空白對照組降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(6)PBMC培養(yǎng)至9天后,各抗原均能促進CD8+T細胞和NKT細胞增殖,M.tb-HAg能促進γδT細胞增殖,相較于空白對照組差異有統(tǒng)計學意(P<0.05)。(7)除了CFP和LM外,其它抗原均能促進增殖的CD8+T細胞分泌TNF-α,而LM卻能起到抑制作用,相較于空白對照組差異有統(tǒng)計學意(P<0.05)。此外,除了WCL,TLIP和LM外,其它抗原均能促進增殖的γδT細胞分泌
9、TNF-α,相較于空白對照組差異有統(tǒng)計學意(P<0.05)。(8)所有抗原均能促進增殖的CD8+T和CD4+T細胞分泌IFN-γ,而其中的WCL,ASLIP,M.tb-HAg,LM和LPS還能促進增殖的γδT細胞分泌IFN-γ,相較于空白對照組差異有統(tǒng)計學意(P<0.05)。(9)除了TLIP,PSLIP外,其它抗原均能促進未增殖的CD4+T細胞分泌IL-4,相較于空白對照組差異有統(tǒng)計學意(P<0.05)。
結論:(1)當以M
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