腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放射敏感性的離體研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦腫瘤，占全部原發(fā)性惡性腫瘤的1.6％，其中又以Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤-多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性程度最高。腦膠質(zhì)瘤的治療以外科切除為主，但由于其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，肉眼難以分辨其明確邊界，腫瘤常難以徹底切除。盡管近年來(lái)在膠質(zhì)瘤的綜合治療上取得了不少的進(jìn)步，但預(yù)后仍然很差，腫瘤在治療原位的復(fù)發(fā)仍是一個(gè)比較普遍的現(xiàn)象。接受了外科手術(shù)、術(shù)后放療及化療綜合治療手段的患者平均生存期為14.6月。 腦膠質(zhì)瘤的臨床治療缺乏突破性

2、進(jìn)展的一個(gè)重要原因很可能是忽視了該病的細(xì)胞起源。為了取得實(shí)質(zhì)上的進(jìn)步，我們需要進(jìn)一步了解膠質(zhì)瘤對(duì)現(xiàn)有治療措施抵抗性的機(jī)制以及初次治療后復(fù)發(fā)的原因。目前關(guān)于在膠質(zhì)瘤放療后復(fù)發(fā)這個(gè)普遍的現(xiàn)象中起關(guān)鍵作用的是哪種細(xì)胞正逐漸成為一個(gè)熱門話題。先前的觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤細(xì)胞術(shù)后殘留是復(fù)發(fā)的根源。隨著腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)的提出，認(rèn)為一小部分因惡性轉(zhuǎn)化而獲得了自我更新能力的干細(xì)胞或前體細(xì)胞，可能是決定腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和對(duì)治療敏感與否的關(guān)鍵細(xì)胞。最近國(guó)內(nèi)

3、外一些學(xué)者陸續(xù)從不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤和體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中分離培養(yǎng)出CD133陽(yáng)性的腫瘤干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們?cè)隗w外培養(yǎng)條件下可以自我更新，具有多向分化潛能，連續(xù)移植均能夠穩(wěn)定地獲得與親本腫瘤表型一致的移植瘤。因而被認(rèn)為在決定膠質(zhì)瘤的起源、維持膠質(zhì)瘤的惡性表型等方面起著十分重要的作用。以上述研究理論為依據(jù)，本課題提出腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞如在其它惡性腫瘤組織中的腫瘤干細(xì)胞一樣，在惡性膠質(zhì)瘤組織中大多處于靜止?fàn)顟B(tài)，具有明顯的輻射抵抗性，X射線、γ射

4、線等電離輻射對(duì)其幾乎不起作用。因而，成為膠質(zhì)瘤放療后原位復(fù)發(fā)重要原因之一的假說(shuō)。 為了驗(yàn)證上述假說(shuō)并闡明腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在當(dāng)前膠質(zhì)瘤放射治療中的輻射抵抗性，在本課題的第一部分，采用CD133標(biāo)記腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，以免疫磁珠法從惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和新鮮人惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離出CD133陽(yáng)性細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Nestin，誘導(dǎo)分化后檢查分化細(xì)胞標(biāo)志物β-TubulinⅢ、GFAP、MB

5、P的表達(dá)以及電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察和裸鼠移植致瘤實(shí)驗(yàn)對(duì)其干細(xì)胞特性加以鑒定，得到以下結(jié)果證明我們分離所得到的CD133陽(yáng)性細(xì)胞是腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞：(1)CD133陽(yáng)性的細(xì)胞能夠自我更新并連續(xù)形成亞克?。?2)保持著未分化狀態(tài)，具有多向分化潛能；(3)CD133陽(yáng)性的細(xì)胞裸鼠移植后能夠產(chǎn)生與親本腫瘤表型一致的移植瘤，而CD133陰性細(xì)胞不具有上述所有特性。因而，CD133陽(yáng)性的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞產(chǎn)生明顯的腫瘤致瘤性。 在第二部分的實(shí)驗(yàn)中，使用

6、60Coγ射線照射體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞、自身存在于U251、人惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，以對(duì)比研究它們的放射敏感性。采用TUNEL原位末端標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)凋亡、AnnexinV-FITC檢測(cè)凋亡率，流式細(xì)胞儀及裸鼠移植實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)輻射前后細(xì)胞周期及致瘤性的變化，并得到如下結(jié)果： 1、體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞周期分布為G0-G1期占51.65±2.75％，G2-M期23.35±1.25％，S期24.15±2.35％。

7、它們生長(zhǎng)、代謝旺盛，對(duì)電離輻射敏感，不同劑量的60Coγ射線可誘導(dǎo)凋亡。大于2Gy以上的各照射組凋亡率與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞接受2Gy以上劑量照射以后不再具有致瘤性。 2、U251細(xì)胞株和人惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本細(xì)胞株在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)、代謝旺盛，對(duì)60Coγ射線也表現(xiàn)出與體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞相似的輻射敏感性。但明顯的區(qū)別在于：當(dāng)U251和人惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本細(xì)胞株接受1

8、4Gy以下劑量照射后行裸鼠移植仍具有致瘤性。 3、不同劑量的60Coγ射線照射U251和人惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本細(xì)胞株后，應(yīng)用免疫磁珠分選其中的CD133陽(yáng)性和CD133陰性細(xì)胞并行AnnexinV-FITC染色顯示：CD133陰性的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)電離輻射敏感，各照射組凋亡率與對(duì)照組相比存在顯著性差異(P＜0.05)，裸鼠移植實(shí)驗(yàn)均不具有致瘤性；而CD133陽(yáng)性的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞則表現(xiàn)為在14Gy以下，各照射組凋亡率與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差

9、異(P＞0.05)，裸鼠移植實(shí)驗(yàn)仍然具有致瘤性。 4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)U251和人惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本細(xì)胞株中的CD133陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)：自身存在于U251和人惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本細(xì)胞株中的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞所占比例不高，范圍在9.60-12.18％之間，但其大多處于G0-G1期，約占87.4±4.9％，而S期占6.97±2.73％，G2-M期占6.66±3.25％。與同時(shí)位于其中的CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期(G0-G1期占

10、57.35±0.35％，G2-M期18.17±7.83％，S期24.55士7.45％)相比，為不活躍的細(xì)胞周期，相對(duì)處于靜止?fàn)顟B(tài)。 總之，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，結(jié)果表明：體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞處于活躍的細(xì)胞周期中，生長(zhǎng)代謝旺盛。它們對(duì)電離輻射敏感，不同劑量的60Coγ射線可誘導(dǎo)凋亡，低劑量的電離輻射可以破壞腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性。而自身存在于U251和人惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本細(xì)胞株中的對(duì)維持膠質(zhì)瘤惡性表型起關(guān)鍵作用的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞則大多處