家蠅抗菌肽相關基因芯片的制備和應用及一個新抗菌肽基因的克隆分析.pdf

1、抗菌肽(antibacterial peptides，簡稱ABP)是一類由結構基因編碼產生的小分子肽類物質，廣泛存在于生物體內，是構成其自身免疫體系的重要組分，能非特異性的抗細菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原體，且對腫瘤細胞、多重耐藥菌也有明顯的殺傷作用，且對正常生物體細胞無害，作用的機理非常獨特，是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕帲蔀槟壳吧茖W領域研究中的一大研究熱點。 家蠅從幼蟲到成蟲常生活在垃圾堆、禽畜糞便等有多種病原菌

2、孳生的環(huán)境中，攜帶多種有害病原微生物，能在人、畜中通過機械傳播多種疾病，自身卻不會因為感染病原菌而死亡，這可能緣于其獨特的天然免疫活性物質抵抗各種微生物的浸染，抗菌肽在其中起著主要的作用。家蠅在我國分布廣泛，容易飼養(yǎng)，且養(yǎng)殖的成本較低，在醫(yī)藥開發(fā)應用方面是一個很好的昆蟲資源。但從家蠅體內提取天然抗菌活性物質的成本較高，人工合成也較昂貴，通過基因工程方法可能是規(guī)模制備其抗菌肽的理想途徑之一，而該方法的前提是要獲取其有關的抗菌肽基因。

3、 基因芯片技術是近年來新興的一種分子生物學技術，具有快速、高效、敏感、平行性等許多優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)方法一次只能研究一條或少數幾條基因的局限性，在基因差異表達的篩選、新基因的發(fā)現、突變基因的檢測及基因多態(tài)性分析等方面顯示出了很好的應用前景。用該技術用于家蠅抗菌肽相關基因的篩選研究還未見報道，本研究以GenBank中部分昆蟲抗菌肽基因序列為目標設計寡核苷酸(oligonucleotide)探針，制備成寡核苷酸（oligo）芯片，以篩選家蠅

4、抗菌肽相關基因，并對所篩選出的其中一個基因的cDNA序列進行克隆，運用生物信息學軟件進行初步分析。 研究目的 運用基因芯片技術篩選家蠅抗菌肽相關基因，對其中篩選出的一個基因的cDNA序列進行克隆分析，為進一步研究家蠅抗菌肽結構和功能，揭示其在家蠅天然免疫體系中所起的作用，進而為用基因工程方法生產家蠅抗菌肽打下基礎。 研究方法 1.家蠅抗菌肽基因芯片的制備與相關基因的篩選從GenBank數據庫中獲取部分昆蟲

5、抗菌肽基因序列，運用NCBI中相關服務器對各基因的全長進行分析，找出其編碼區(qū)，分析出各自的保守序列，以此作為設計oligo 探針的備選序列，用生物學軟件Array Designer 2.0對所選序列設計特異性高、Tm 值接近、長度均一的oligo探針，用直接點樣法將探針點印在特制玻片上制備成寡核苷酸(oligonucleotide)芯片；提取經大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)免疫誘導

6、后24小時的家蠅三齡幼蟲脂肪體總RNA，逆轉錄成cDNA并標記上熒光標記物Cy3，與制備的基因芯片雜交，經洗片、掃描處理后進行數據分析。 2.一個家蠅新抗菌肽基因cDNA的克隆與生物信息學分析對篩選出的其中一個有效雜交信號點所對應基因的氨基酸保守域設計簡并引物，行RT-PCR擴增出一個同源片斷；結合cDNA文庫（本實驗室已構建）載體上的下游引物，從所克隆到的同源片斷中設計出一條特異性上游引物，以cDNA文庫為模板，行PCR擴增

7、出該基因的3′端；再結合文庫載體上的上游引物，從所克隆到的3′端序列中設計出一條特異性下游引物，以cDNA文庫為模板，行PCR擴增出該基因的5′端；將兩次所克隆到的cDNA片斷進行拼接，獲得一條家蠅新抗菌肽基因的cDNA序列，并運用生物信息學相關軟件對其進行初步分析。 研究結果 1.家蠅抗菌肽基因芯片的制備與相關基因的篩選據GenBank數據庫中所獲取的部分昆蟲抗菌肽基因序列，用NCBI中相關生物學軟件分析出各自的保守序

8、列，根據oligo探針的設計原則，用Array Designer 2.0生物學軟件共設計出長度為50bp、Tm為72～77℃、GC含量為40～60％的oligo探針186條，將之點印在特制玻片上制備成oligo芯片；用逆轉錄PCR標記技術對誘導后家蠅三齡幼蟲脂肪體總RNA反轉錄成cDNA并進行Cy3熒光素標記，與制備的芯片雜交，經洗片、掃描后進行數據分析，在兩次重復雜交實驗中均能檢測到有效雜交信號的基因點共有15個，在其中一次雜交實驗中

9、檢測到有效雜交信號的基因點共12個，其中所有陽性對照信號清晰，陰性對照和空白對照均為陰性。 2.一個新抗菌肽基因cDNA的克隆與生物信息學分析對其中一個有效雜交信號的基因點所對應基因的氨基酸保守域設計簡并引物，經RT-PCR擴增出一長為131bp的同源片斷；結合cDNA文庫載體上的上、下游引物，以cDNA文庫為模板，分別行PCR擴增出長為366bp的3′端cDNA序列和457bp的5′端cDNA序列，將所得3′端與5′端cDN

10、A序列進行拼接，得到一長為460bp的家蠅抗菌肽新基因的cDNA序列，生物信息學分析該基因序列所編碼的蛋白質屬于抗菌肽Attacin基因家族，其cDNA序列的3′端是完整的，存在有一個AATAAA的poly（A）加尾信號和一個poly(A)尾巴，但5′顯示還不完整，Blast比較顯示與雙翅目刺舌蠅、新陸原伏蠅抗菌肽Diptericin基因的同源性較高，分別為80％、91％，推導出的所編碼的氨基酸序列Blast比較顯示與舌刺蠅Dipter

11、icin氨基酸序列同源性為77％、與果蠅Diptericin氨基酸序列同源性為59％、與新陸原伏蠅Diptericin氨基酸序列同源性為51％，初步判斷該cDNA序列可能為家蠅一新抗菌肽基因。 結論 1.首次制備了家蠅抗菌肽相關基因芯片，并初步篩選到了27個可能與家蠅抗菌肽相關的基因，為進一步克隆其新抗菌肽基因奠定了良好的工作基礎； 2.對其中一個有效雜交信號的基因點所對應的基因進行了克隆，成功克隆到了一長為46