鋁致tau蛋白異常磷酸化作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　 (1)通過現(xiàn)況調查闡明鋁職業(yè)接觸人群的MCI患病情況，建立鋁職業(yè)接觸人群所引起的tau蛋白異常磷酸化位點與MCI之間的聯(lián)系；
　　 (2)通過體內實驗探討三氯化鋁對小鼠學習記憶能力的影響及其與腦組織tau蛋白異常磷酸化表達的關聯(lián)性；
　　 (3)在人群研究，體內實驗的基礎上，進行體外實驗，采用人源性神經(jīng)母細胞瘤細胞株（SH-SY5Y)，利用鈣調蛋白激酶-Ⅱ（CaMK-Ⅱ）拮抗劑KN93和蛋白磷酸酶-

2、2A（PP-2A）激動劑神經(jīng)鞘氨醇，以對抗tau蛋白的過度磷酸化研究鋁致tau蛋白異常磷酸化的機制。
　　 方法：
　　 (1)選取某電解鋁廠其電解車間66名退休工人作為接觸組，對照工人來自同一地區(qū)的某面粉廠退休工人70名，采用簡短精神狀態(tài)量表(MMSE)篩選MCI患者；同時采集所有研究對象空腹肘靜脈血，分離血清，采用電感耦合等離子質譜法(ICP-MAS)測定血清鋁含量；分離淋巴細胞提取其蛋白，用western blot

3、測定淋巴細胞P-tau181、231、262、396磷酸化程度以及總tau(tau5)表達水平；分析兩組間血鋁濃度、MCI檢出率、P-tau181、231、262、396及tau5表達的變化情況，同時應用多元統(tǒng)計學方法探討MMSE得分的影響因素，血鋁水平與MCI患病率的關聯(lián)性，MMSE得分、血鋁水平與P-tau181、231、262、396及tau5表達的相關性。
　　 (2)選取剛斷乳的昆明種小白鼠共320只，按體重隨機分為4

4、組，每組80只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。將AIC13混入飼料中喂養(yǎng)小鼠，分為高、中、低劑量組，劑量分別為120，12，1.2mg/kg.d，對照組正常飼養(yǎng)。染毒時間為2年，每半年進行相應指標的測定，采用水迷宮實驗、避暗實驗、跳臺實驗檢測小鼠的認知功能；神經(jīng)行為測定完畢后處死小鼠取腦組織，采用電感耦合等離子質譜法(ICP-MAS)測定血清鋁水平和腦鋁含量；應用HE染色和電鏡觀察小鼠腦組織的變化；提取腦組織蛋白用Western-blot檢測小鼠

5、腦組織P-tau181、231、262、396及tau5表達情況；分析不同劑量、不同時間小鼠學習記憶的變化，及其與血鋁、腦鋁、腦組織P-tau181、231、262、396及tau5表達的變化的關聯(lián)。
　　 (3)選取SH-SY5Y細胞進行染毒，實驗分組分為空白對照、200μM AL3+、400μM AL3+、800μM AL3+、800μM AL3+＋0.5μMKN93、800μM AL3+＋5nM神經(jīng)鞘氨醇、800μM AL

6、3+＋DMSO、DMSO，染毒和干預48小時后測定各項指標。采用CCK-8法測定細胞活力；采用Flu-3AM標記，應用流式細胞術測定細胞內Ca2+濃度；用ELISA方法測定CaM含量、CaMK-Ⅱ含量、PP-2A含量；提取細胞蛋白用Western-blot檢測細胞蛋白P-tau181、231、262、396及tau5表達情況；分析CaMK-Ⅱ拮抗劑KN93和PP-2A激動劑神經(jīng)鞘氨醇對抗Tau蛋白的異常磷酸化。
　　 結論：人群

7、研究結果提示長期鋁接觸可引起工人的認知功能障礙，可能是MCI發(fā)病的危險因素之一，高齡、男性和文化水平低、血鋁水平高可能是認知功能障礙的高危因素；而淋巴細胞P-tau396、P-tau231、P-tau181的表達更適合監(jiān)測鋁作業(yè)人員認知功能的下降。體內實驗研究提示長期喂養(yǎng)三氯化鋁可引起小鼠學習記憶功能的下降，其下降程度與染鋁劑量和染鋁時間有關；海馬組織是負責學習記憶功能解剖結構，從病理結果顯示三氯化鋁可以引起海馬區(qū)神經(jīng)細胞的變化，細胞的

8、超微結構顯示細胞內線粒體、內質網(wǎng)和突觸均受到損害；腦組織tau5、P-tau396、P-tau262、P-tau231的表達也隨著染鋁劑量劑量的增加表達增高，P-tau262、P-tau231蛋白表達變化除與劑量有關還與時間有關。提示長期染鋁導致小鼠學記憶功能的障礙與磷酸化tau蛋白的異常表達有關。體外干預實驗結果提示三氯化鋁可引起SH-SY5Y細胞tau5、P-tau396、P-tau231、P-tau181表達的異常，其機制與由Ca