Necrostatin-1抑制創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝臟炎癥因子的機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討程序性壞死特異性抑制劑-1（Necrostatin-1，Nec-1）抑制創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝臟炎癥因子的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制。
　　內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分，第一部分：采用創(chuàng)傷失血性大鼠休克模型，將30只雄性SD大鼠利用隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器分為假手術(shù)組、DMSO組、Nec-1組，每組10只。假手術(shù)組不行鉗夾斷肢及失血操作和液體回輸，僅進(jìn)行腹腔水合氯醛麻醉、剝離左頸動(dòng)脈、結(jié)扎左頸動(dòng)脈。DMSO組建立創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，并回

2、輸血液及液體，再灌注前5 min前股靜脈給予DMSO溶劑。Nec-1組建立創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，并回輸血液及液體，再灌注前5 min股靜脈給予Nec-1，1 mg/kg。再灌注后24 h各處死動(dòng)物10只，取動(dòng)物血清及肝臟組織。檢測(cè)血清中各時(shí)間點(diǎn)ALT、AST水平；HE染色觀(guān)察肝臟病理變化；Tunel法檢測(cè)24h后肝組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況；透射電鏡觀(guān)察再灌注后24 h后細(xì)胞器水平的細(xì)胞壞死；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)24h

3、后肝臟組織中巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（Macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）mRNA、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）mRNA含量。酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）分析24h血清中MIP-1α、MCP-1含量。第二部分：采用創(chuàng)傷失血性大鼠休克模型，將96只雄性SD大鼠利用隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器隨機(jī)分為假手術(shù)組、DMSO組、Nec-1組，每組3

4、2只。假手術(shù)組不行鉗夾斷肢及失血操作和液體回輸，僅進(jìn)行腹腔水合氯醛麻醉、剝離左頸動(dòng)脈、結(jié)扎左頸動(dòng)脈。DMSO組建立創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，并回輸血液及液體，再灌注前5 min前股靜脈給予DMSO溶劑。Nec-1組并回輸血液及液體，再灌注前5 min股靜脈給予Nec-1，1 mg/kg。再灌注后分別在2h、8h、16h、24h各處死動(dòng)物8只，取動(dòng)物血清及肝臟組織。檢測(cè)血清中ALT、AST水平；HE染色觀(guān)察肝臟病理變化；酶聯(lián)免疫分析法（EL

5、ISA）分析血清中HMGB-1(high mobility group B1,HMGB-1)含量；蛋白質(zhì)免疫印跡法（ Western Blotting）分別檢測(cè)肝臟組織中胞漿和總蛋白的HMGB-1含量；蛋白免疫印跡法檢測(cè)肝臟組織中RIP3蛋白的含量。
　　結(jié)果：第一部分：在制備模型后24h，DMSO組和Nec-1組中肝臟結(jié)構(gòu)遭到破壞，光鏡下模型組及DMSO組可見(jiàn)肝細(xì)胞氣球樣變，小葉結(jié)構(gòu)布局雜亂，淤血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，Nec-1組

6、肝組織損傷明顯減輕。透射電鏡 DMSO組下可見(jiàn)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)尚可，胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)粒體數(shù)量溶解、嵴消失、減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少，溶酶體增多，脂滴增多，染色質(zhì)出現(xiàn)粗顆粒，Nec-1組中損傷較 DMSO組減輕。Tunel檢測(cè)顯示DMSO組與Nec-1組中凋亡細(xì)胞情況并無(wú)明顯差異（P＞0.05）。Nec-1組中24h血清 ALT（248.05±67.55、127.2±20.04比73.46±23.75）、AST（823.74±89.04、416.67±10

7、0.46比236.36±67.79）及血清MIP-1α（0.249±0.149、0.182±0.099比0.063±0.026）、MCP-1（981.519±60.483、714.424±55.092比310.517±15.877）含量與模型組及DMSO組比較，有明顯下降（P＜0.05）。Nec-1組中肝臟組織 MIP-1α mRNA（7.134±2.811、2.924±1.153比1.000±0.000）、MCP-1mRNA（7.31

8、9±0.517、5.554±0.435比1.000±0.000）與DMSO組比較，有明顯下降（P＜0.05）。第二部分：Nec-1組與DMSO組比較，血清8h、16h、24h中ALT、AST及HMGB-1含量有顯著差異（P＜0.05）；光鏡下DMSO組及Nec-1組可見(jiàn)肝臟結(jié)構(gòu)遭到破壞，光鏡下模型組及 DMSO組可見(jiàn)肝細(xì)胞氣球樣變，小葉結(jié)構(gòu)布局雜亂，淤血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，Nec-1組肝組織損傷明顯減輕；與DMSO組相比，Nec-1組肝

9、細(xì)胞中胞漿蛋白HMGB-1在8h（0.025±0.003、0.184±0.007比0.124±0.013）、16h（0.022±0.004、0.400±0.019比0.318±0.030）、24h（0.022±0.003、0.341±0.051比0.245±0.014）有明顯下降（P＜0.05），Nec-1組總蛋白 HMGB-1在8h（1.010±0.042、1.348±0.046比1.298±0.073）、24h（1.053±0.04

10、8、1.438±0.634比1.374±0.060）有明顯下降（P＜0.05）。Nec-1組中 RIP3蛋白含量在8h（0.169±0.023、0.673±0.042比0.543±0.126）、16h（0.178±0.022、1.044±0.115比0.836±0.090）、24h（0.186±0.023、1.446±0.141比1.266±0.128）有明顯下降。
　　結(jié)論：1.Nec-1可以有效降低創(chuàng)傷失血性休克對(duì)肝臟的損傷，