黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達.pdf

1、乳及乳制品是人類改善營養(yǎng)、增強體質的理想食品。牛乳中含有5％左右的乳糖，我國人群中有很大一部分人(約75％～95％)患有乳糖不耐受癥，嚴重影響乳及乳制品的推廣。乳糖酶能將乳制品中的乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，利用乳糖酶生產低乳糖制品或口服酶制劑，能夠有效解決“乳糖不耐癥”問題。 本研究從一株產乳糖酶的黑曲霉Aspergillus niger DL116中克隆獲得乳糖酶DNA和cDNA序列，經過序列分析顯示，乳糖酶基因DNA序列長

2、3368 bp，其中含有8個內含子，cDNA編碼區(qū)長2967 bp，GC含量為52.8％，共編碼988個氨基酸，氨基酸序列中共含有12個潛在的N-糖基化位點。此基因已在GENBANK中注冊，登錄號為：ACCESSION No.EF103141。 將乳糖酶cDNA序列克隆到分泌型酵母表達載體pPIC9K上，電擊轉化Pichiapastoris GS115，經過MM、MD平板篩選出156株GS115 His<'+>Mut<'+>表

3、型轉化子，并對重組酵母進行乳糖酶基因的PCR分析，選取65株PCR檢測陽性的酵母轉化子進行乳糖酶活性篩選，獲得一株高效表達乳糖酶的重組酵母工程菌，將此菌株命名為LAC-47，對其進行搖瓶培養(yǎng)，甲醇誘導12 d后乳糖酶活力達到271.15 U/mL，表達量為0.66mg/mL。 將發(fā)酵液經過超濾濃縮、透析、DEAE-52纖維素離子交換層析及Sephacry1<'TM>S-200分子篩層析進行分離純化。純化后該酶經PAGE電泳鑒定

4、為單一條帶，達到電泳純，單亞基分子量為130～140 kD，比活力從粗酶液的275.5 U/mg提高到532.9U/mg。 對表達的乳糖酶進行了酶學性質的研究，其酶促反應最適溫度為60℃，60℃下保溫1 h酶活基本不變；最適反應pH在3.0～4.2之間，并且pH穩(wěn)定性較好，在pH2.5～9.0范圍內較穩(wěn)定，尤其在pH7.5～9.0范圍內處理2 d，酶活均保持在94％以上，說明該酶有很好的耐堿性。所試離子和化學試劑對酶促反應的影