胰高血糖素樣肽-1對晚期氧化蛋白產物誘導足細胞凋亡的影響及機制.pdf

1、背景:
　　糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病的嚴重微血管并發(fā)癥，是導致患者死亡、殘疾的主要原因之一。
　　越來越多的研究證實，足細胞的損傷和凋亡在糖尿病腎病的早期發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。
　　目前，AOPPs(advancedoxidative protein products，晚期氧化蛋白產物)在糖尿病腎病中的致病作用逐漸引起了廣泛的關注。GLP-1（glucagon-lik

2、e peptide-1，胰高血糖素樣肽-1）在臍靜脈內皮細胞、胰島細胞、心肌細胞、視網膜細胞等可拮抗AGEs或AOPPs的致炎癥、致氧化應激作用。
　　探討減少足細胞的早期損傷和凋亡作用因素和機制，將為臨床糖尿病腎病的早期干預提供新的思路和策略。本研究以AOPPs誘導足細胞凋亡為研究模型，探討GLP-1干預對足細胞凋亡的影響及其相關機制，以期為拓展GLP-1的腎臟保護作用提供實驗基礎。
　　目的:
　　本課題擬在以AO

3、PPs誘導足細胞凋亡為研究模型的基礎上，通過觀察GLP-1干預對AOPPs誘導足細胞凋亡的影響，同時檢測其對細胞凋亡相關蛋白及對AOPPs-RAGE通路的影響，初步探討GLP-1對AOPPs誘導足細胞凋亡的影響及分子機制。
　　內容:
　　課題分為以下兩大部分:
　　第一部分 GLP-1對AOPPs誘導足細胞凋亡的影響
　　目的:
　　以AOPPs誘導足細胞凋亡為研究模型，觀測GLP-1干預對AOPPs誘導

4、足細胞凋亡的影響。
　　方法:
　　1.體外制備、鑒定AOPP
　　將20 mg/ml小鼠血清白蛋白(RSA)與等體積的40 mmol/l次氯酸混合，放置30min，制備出RSA與次氯酸摩爾比為1∶140的AOPP。制備的AOPP經由無內毒素PBS透析24h，除去過多游離的次氯酸。用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存。20 mg/ml RSA與PBS等體積混合，作為對照。以熒光分光光度計鑒定AOPP。
　　

5、2.培養(yǎng)足細胞
　　增殖期:33℃孵箱培養(yǎng)。在重組小鼠γ-干擾素誘導下增生，待其長至約85％，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA消化細胞后傳代。分化期:待細胞長至30-40％時，用不含IFN-γ的培養(yǎng)基轉入37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2-3次，約培養(yǎng)10-14天。目標:長出足突，最好長出二級足突。
　　3.CCK8法測定細胞的活力
　　實驗分組:200μg/mLAOPPs與不同濃度GLP-1(0、10、50、100、20

6、0 nmol/L)共同作用足細胞48h。
　　將上述各組細胞按每孔5×104個細胞的密度種于96孔板的玻片上，待達到70％-90％融合時收集細胞。每孔加入10μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h。在酶聯免疫檢測儀OD450nm處測量各孔的吸光值。同時設置空白孔和對照孔。細胞存活率=（測定組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）。
　　4.Hoechst33258熒光染色觀察各組足細胞形態(tài)學變化
　　5.流

7、式細胞儀檢測分析足細胞凋亡率
　　實驗共分為4組，依次為陰性對照RSA組、200μg/mLAOPPs、100nmol/LGLP-1組、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1組，作用足細胞48h后，收集各組細胞，離心，棄上清，PBS液清洗二次，均勻吹散沉淀細胞，加入AnnexinⅤ和碘化丙啶(Pl)，避光放置15min，于流式細胞儀上樣檢測，軟件分析細胞凋亡率。
　　統(tǒng)計學處理
　　采用SPSS20.

8、0進行統(tǒng)計分析，實驗數據屬計量資料，則以均數±標準差（(x)±s）表示，采用單向方差分析(One-Way ANOVA)檢驗，兩兩比較采用LSD法。相關分析采用Spearman相關分析法。P＜0.050，具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.研究不同濃度GLP-1(0、10、50、100、200 nmol/L)拮抗200μg/mLAOPPs對足細胞的活性影響
　　AOPPs組的OD值為0.10±0.02，與陰性對照組(0

9、.35±0.02)相比，有顯著差異(P=0.000)。
　　2.細胞形態(tài)學變化
　　藥物干預各組足細胞48h后，Hoechst33258染色，于熒光顯微鏡下觀察:可見陰性對照組足細胞細胞核染色質呈均勻熒光;AOPPs組的細胞核固縮，核致密濃染或裂解呈碎塊狀，核染色質邊集;AOPPs+GLP-1細胞核濃染、固縮及核碎裂的細胞較AOPPs組明顯減少。
　　3.流式細胞術檢測細胞早期凋亡率
　　各組細胞經藥物作用48h

10、后，AOPPs組的足細胞總凋亡率為（26.78±2.58）％。
　　結論:
　　GLP-1在一定的濃度范圍(50～200 nmol/L)內有拮抗AOPPs抑制足細胞活性的作用，而且可部分減少AOPPs誘導的足細胞凋亡。
　　第二部分 GLP-1抑制AOPPs誘導足細胞凋亡的機制
　　第一節(jié) GLP-1對AOPPs誘導足細胞的氧化應激caspase家族主要酶的影響
　　目的:
　　通過激光共聚焦檢測足細

11、胞氧化應激水平，并采用酶聯反應法檢測caspase-9、-3酶活性，探討GLP-1在足細胞發(fā)揮抗凋亡作用的可能機制。
　　方法:
　　1.激光共聚焦檢測活性氧(ROS)
　　在處理好的足細胞中加入DCFH2DA熒光探針（用無血清培養(yǎng)基以1∶1000稀釋）對細胞內ROS進行熒光標記，在37℃含5％C02的培養(yǎng)箱中孵育30min，棄去培養(yǎng)液，PBS液清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察各組中細胞內熒光強度。
　　2.ELIS

12、A法檢測細胞凋亡蛋白酶caspase-9、-3酶活性
　　各組細胞孵育48h，消化、離心后、用細胞裂解液重懸，再加入對應的反應底物。37℃水浴2h后，加樣至96孔培養(yǎng)板，最后用酶聯免疫檢測儀測OD值，檢測波長為405 nm。
　　統(tǒng)計學處理
　　采用SPSS20.0進行統(tǒng)計分析，實驗數據屬計量資料，以均數±標準差(i±s)表示，采用單向方差分析(One-Way ANOVA)檢驗，兩兩比較采用LSD法。P＜0.050，具

13、有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　AOPPs作用于足細胞48h后，細胞內ROS水平升高，凋亡蛋白酶caspase-9、-3的活性增加，GLP-1可部分減少AOPPs誘導的這些效應。
　　第二節(jié) Exendin9-39對AOPPs誘導的RAGE信號通路的影響
　　目的:
　　研究GLP-1受體抑制劑Exendin9-39對AOPPs-RAGE信號通路及其下游Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，進一步探討GLP-1

14、減輕AOPPs所致足細胞凋亡的分子機制。
　　方法:
　　1.實驗共分為4組，分別為陰性對照組、200μg/mLAOPPs、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1組、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1組+ GLP-1受體抑制劑(exentin9-39)，作用足細胞48h。
　　2.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡（余同第一章）
　　3.qPCR測RA

15、GE mRNA
　　細胞使用胰酶進行消化，以1×105個/mL接種于培養(yǎng)皿內，培養(yǎng)24h，吸去培養(yǎng)基，干預結束后，Trizol提取總RNA，并采用紫外分光光度計進行RNA含量的檢測，根據RT-PCR試劑盒進行操作，使用熒光定量PCR法進行基因相對表達量的檢測。
　　4.Western blotting法檢測細胞RAGE、Bcl-2、Bax蛋白的表達
　　收集各組細胞，根據蛋白提取試劑盒操作，分別提取各組細胞總蛋白及核蛋

16、白，采用BCA法測定蛋白濃度。每組蛋白質樣本20μg，以12％SDS-PAOPP進行電泳，轉膜后5％脫脂奶粉封閉2h，洗膜后加入RSA-TBS稀釋的抗RAGE抗體、抗Bcl-2單克隆抗體(1∶1000)，抗Bax(1∶2000)單克隆抗體，4℃孵育過夜，再次洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000)雜交1h，洗膜后顯色，結果用Image J分析軟件對目的條帶進行灰度值分析。
　　統(tǒng)計學處理
　　采用SPSS20.0進