白藜蘆醇對(duì)高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)和作用機(jī)制.pdf

1、目的:糖尿病所致的慢性并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人們的健康，而糖尿病血管病變是最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一。糖尿病血管病變的發(fā)病原因?yàn)楦哐黔h(huán)境引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。由于糖尿病血管病變目前還沒(méi)有理想的治療方法，因而研究相關(guān)藥物具有重要的意義。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)，是一種多酚類植物抗毒素，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)主要有抗腫瘤、保護(hù)心血管、抗氧化、抗衰老作用、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗菌、抗炎、抗糖尿病作用和調(diào)節(jié)雌激素樣等作用，但白藜蘆醇對(duì)高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮

2、細(xì)胞的效應(yīng)及作用機(jī)制尚未完全闡明。相關(guān)研究表明一氧化氮(nitric oxide，NO)為內(nèi)皮依賴性舒張因子，被稱為抗粥樣硬化因子，E選擇素(endothelial leukocyte adhesion molecule1，E-selectin)為內(nèi)皮特異性，為粥樣硬化因子。本研究通過(guò)高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilical vein endothelial cells，HUVECs)探討白藜蘆醇對(duì)高糖環(huán)境下血

3、管內(nèi)皮細(xì)胞中的效應(yīng)和作用機(jī)制，為其在在臨床及科研領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法:選取2013年在濰坊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科取正常分娩的健康新生兒10-15cm的臍帶置于無(wú)菌臍帶保存液，磷酸鹽緩沖液(phosphate bufferedsolution，PBS)洗凈血液，應(yīng)用0.25％胰蛋白酶室溫消化分離臍血管內(nèi)皮細(xì)胞，臍血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于含有20％濃度的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM(dulbecco

4、's modified eagle medium)培養(yǎng)液瓶中，培養(yǎng)液每2-3天更換原培養(yǎng)液的一半以移除未粘附的細(xì)胞，并分離細(xì)胞、接種細(xì)胞，應(yīng)用免疫組化法識(shí)別血管性假血友病因子(von Willebrand factor，vWF)以鑒定人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞成長(zhǎng)良好后棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，0.25％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化并傳代，保留第二代和

5、第三代細(xì)胞。當(dāng)覆蓋率達(dá)到80％時(shí)具備實(shí)驗(yàn)條件，并作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，高糖-脂培養(yǎng)組(32.8mmol/L葡萄糖和0.45mmol/L棕櫚酸)，白藜蘆醇治療組（32.8mmol/l葡萄糖、0.45 mmol/L棕櫚酸、0.2μmol/l白藜蘆醇4小時(shí)預(yù)處理并在先前制備的含有20％濃度的的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)12小時(shí)），Trizol法分離RNA，通過(guò)RT-PCR(reverse transcription polymerase

6、chainreaction)以看家基因β-肌動(dòng)蛋白基因(β-actin gene)作為內(nèi)參檢測(cè)E選擇素mRNA表達(dá)水平。由100 nmol/l胰島素所誘導(dǎo)30分鐘后的培養(yǎng)細(xì)胞上清液，用硝酸還原酶法測(cè)定分析不同實(shí)驗(yàn)組的一氧化氮。通過(guò)檢測(cè)對(duì)照組，高糖-高組、白藜蘆醇治療組的E選擇素mRNA和NO水平來(lái)了解其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。紫外分光光度計(jì)法測(cè)量細(xì)胞蛋白濃度。在不包含抗生素的培養(yǎng)基中接種對(duì)照組細(xì)胞（無(wú)高糖-脂處理），細(xì)胞融合達(dá)60％時(shí)通過(guò)

7、siRNA沉默E選擇素表達(dá)，24小時(shí)后收集細(xì)胞。其中E選擇素表達(dá)沉默的作為實(shí)驗(yàn)組，未沉默的作為對(duì)照組。用40μmol/l、80μmol/l白藜蘆醇孵育細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)E選擇素mRNA表達(dá)以了解沉默效果。HUVECs用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)前饑餓處理。按設(shè)定的濃度將白藜蘆醇(40μmol/l、80μmol/l)溶解于PBS溶液中，按照分組加入各孔，置于37℃培養(yǎng)箱中后迅速吸出藥物溶液，并用4℃的PBS溶

8、液洗3次，再加入1ml水，將孔中細(xì)胞吹下來(lái)，液氮中反復(fù)凍融3次，高速離心20分鐘破碎細(xì)胞。高效液相色譜儀測(cè)定細(xì)胞中白藜蘆醇的含量，了解E選擇素沉默對(duì)細(xì)胞白藜蘆醇攝取的影響(40μmol/l、80μmol/l)。數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用(x)±s表示，計(jì)量資料比較采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.E選擇素基因沉默效果良好。用40μmo/l白藜蘆醇濃度

9、處理E選擇素基因沉默處理的，其白藜蘆醇的細(xì)胞攝取量為2.62 nmol/106，低于E選擇素基因未沉默處理的(7.61 nmol/106)(P＜0.01)，用80μmo/l白藜蘆醇濃度處理E選擇素基因沉默處理的，其白藜蘆醇的細(xì)胞攝取量5.35 nmol/106，低于E選擇素基因未沉默處理的(9.12 nmol/106)(P＜0.01)提示E選擇素至少部分參與白藜蘆醇的細(xì)胞攝取過(guò)程。
　　2.高糖-脂組E選擇素mRNA的表達(dá)為0.6

10、1，大于對(duì)照組的0.52，白藜蘆醇治療組E選擇素mRNA表達(dá)為0.55，小于高糖-脂組E選擇素mRNA表達(dá)(P＜0.05)。高糖-脂環(huán)境下E選擇素mRNA表達(dá)增高，而白藜蘆醇治療可以減少E選擇素mRNA的表達(dá)。
　　3.高糖-脂組NO的表達(dá)為68.25μmol/l，小于對(duì)照組的76.34μmol/l，白藜蘆醇高糖治療組NO的表達(dá)為110.27μmol/l，大于高糖-脂組NO的表達(dá)(P＜0.05)。高糖-脂環(huán)境下NO的分泌減少，而白