LncRNA介導(dǎo)人基因組DNA甲基化研究.pdf

1、DNA甲基化作為一種在表觀遺傳學(xué)上非常關(guān)鍵的標(biāo)記，在生物體中很多過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。比如基因表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞分化，疾病產(chǎn)生，胚胎發(fā)育等過(guò)程中DNA甲基化都發(fā)揮著舉足輕重的作用。目前，已經(jīng)報(bào)道的參與DNA甲基化過(guò)程的酶有：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（Dnmt1），DNA甲基轉(zhuǎn)移酶ⅢA（Dnmt3a），DNA甲基轉(zhuǎn)移酶ⅢB（Dnmt3b）。過(guò)去幾年，在研究植物中的DNA甲基化機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，從頭合成甲基化中有siRNA和lncRNA的參與[1]。去年，

2、中國(guó)學(xué)者在小鼠的骨骼肌成肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有LncRNA Dum調(diào)控其靶基因Dppa2的DNA甲基化從而抑制該基因的表達(dá)，達(dá)到基因沉默的效果[2]。這證明在小鼠中l(wèi)ncRNA能夠通過(guò)介導(dǎo)Dnmts定位到基因的特定位點(diǎn)，導(dǎo)致該位點(diǎn)的DNA甲基化，從而調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞功能。因此，探討在人細(xì)胞中l(wèi)ncRNA與Dnmts結(jié)合并且在基因甲基化過(guò)程的作用是否存在普遍現(xiàn)象具有重要意義，為解釋基因組DNA甲基化機(jī)制提供支持。
　　本文利用經(jīng)典

3、的RNA免疫共沉淀(RNA immunecoprecipitation)技術(shù)來(lái)捕獲由ES向NPC分化過(guò)程中能夠和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用的RNA[3]。并且通過(guò)特定的方法去除基因組DNA的干擾之后，鑒別所捕獲的RNA中是否有l(wèi)ncRNA，以此來(lái)證明在人細(xì)胞分化過(guò)程中l(wèi)ncRNA能夠參與DNA甲基化過(guò)程。用RIP捕獲能夠和Dnmt3b結(jié)合的RNA，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析RNA的類(lèi)型，用RIPSeeker分析Dnmt3b在基因組上可能的結(jié)合

4、位點(diǎn)。并且利用RIP測(cè)序數(shù)據(jù)，采用tophat及cufflink軟件聯(lián)合使用的方法對(duì)RIP數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，并結(jié)合預(yù)測(cè)軟件（CPC、CPAT）評(píng)價(jià)這些得到的轉(zhuǎn)錄物是否存在開(kāi)放閱讀框和開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度及保守性，相鄰核苷酸三聚體在編碼與非編碼區(qū)分布的差異程度等一系列指標(biāo)預(yù)測(cè)其編碼能力強(qiáng)弱，從而判斷一個(gè)轉(zhuǎn)錄物是不是屬于非編碼基因。結(jié)果小結(jié)如下：
　　1、在H9-ES細(xì)胞系，ES向NPC分化第二天的細(xì)胞和來(lái)自于ES的成熟NPC細(xì)胞中，我們共獲

5、得了14957個(gè)新的lncRNA分子，其中有44個(gè)lncRNA分子與mRNA反向配對(duì)；
　　2、在H9-ES細(xì)胞向NPC細(xì)胞分化過(guò)程中Dnmt3b和Dnmt3a的表達(dá)量處于動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中，兩者同時(shí)在分化第二天的時(shí)候表達(dá)量達(dá)到最高，并且Dnmt3b的表達(dá)量比Dnmt3a的表達(dá)量更高；
　　3、通過(guò)利用Dnmt3b和IgG抗體的RIP技術(shù)和RIPseeker分析軟件，我們發(fā)現(xiàn)在在ES細(xì)胞中l(wèi)ncRNA能夠和Dnmt3b結(jié)合，在l

6、ncRNA和基因組結(jié)合位點(diǎn)附近的基因有13個(gè)mRNA，lncRNA和microRNA及Y RNA各1個(gè)。這些RNA結(jié)合位點(diǎn)臨近基因的甲基化水平都是比較低的，這些基因的主要功能是和細(xì)胞跨膜運(yùn)輸和增殖相關(guān)；
　　4、在H9-ES細(xì)胞向NPC細(xì)胞分化過(guò)程中l(wèi)ncRNA能夠和Dnmt3b結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)臨近基因有25個(gè)mRNA，7個(gè)snoRNA，2個(gè)microRNA，lncRNA1個(gè)。并且發(fā)現(xiàn)這些RNA結(jié)合位點(diǎn)臨近基因的甲基化情況都比較高

7、，在這些結(jié)合位點(diǎn)呈現(xiàn)出很高的CpG甲基化現(xiàn)象，并且這些基因的主要功能都是和細(xì)胞分化及神經(jīng)分化相關(guān)；
　　5、NPC細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有和Dnmt3b結(jié)合的RNA，其結(jié)合位點(diǎn)臨近基因有132個(gè)mRNA，16個(gè)snoRNA，5個(gè)microRNA和2個(gè)lncRNA。通過(guò)UCSC，我們發(fā)現(xiàn)這些能夠和Dnmt3b結(jié)合的RNA臨近基因的DNA甲基化水平都比未分化的ES細(xì)胞中高，并且在這些結(jié)合位點(diǎn)的CpG甲基化也很高。并且其結(jié)合位點(diǎn)附近基因的功能都是