吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、【目的】：
　　1、研究吉西他濱在胰腺癌治療中的免疫調(diào)節(jié)作用及其具體分子機(jī)制。
　　2、研究ULBP2在胰腺癌患者血清中的表達(dá)，探討ULBP2的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后間的相關(guān)性，探討血清ULBP2水平對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值。
　　【方法】：
　　1、ELISA檢測(cè)胰腺癌化療藥物吉西他濱作用下的胰腺癌細(xì)胞株分泌可溶型ULBP2蛋白的水平，以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株表達(dá)膜型ULBP2蛋白的水平；
　　2、

2、建立胰腺癌細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)殺傷體系后，通過(guò)CCK8法檢測(cè)吉西他濱對(duì)胰腺癌免疫殺傷敏感性的影響；
　　3、通過(guò)定量PCR技術(shù)、western blot檢測(cè)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞中ADAM10基因和蛋白表達(dá)的影響；進(jìn)一步通過(guò)設(shè)計(jì)合成ADAM10 siRNA并轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，在驗(yàn)證ADAM10表達(dá)水平下調(diào)后，通過(guò)CCK8法檢測(cè)ADAM10siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響，以及通過(guò)ELISA檢測(cè)ADAM10siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞表達(dá)可溶

3、型ULBP2蛋白的影響；
　　4、通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)胰腺癌組織標(biāo)本中ADAM10的表達(dá)水平，以及通過(guò)ELISA檢測(cè)胰腺癌患者血清中sULBP2的表達(dá)水平，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)估在胰腺癌血清中sULBP2的表達(dá)與患者臨床資料和術(shù)后預(yù)后的關(guān)系、及其與組織中ADAM10表達(dá)水平間的相關(guān)性；
　　5、收集吉西他濱處理后的胰腺癌細(xì)胞PANC-1和未經(jīng)處理的對(duì)照組細(xì)胞，通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析處理前后胰腺癌細(xì)胞中環(huán)狀RNA、lncR

4、NA和mRNA的差異表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)生物學(xué)分析，將差異基因按其功能及通路進(jìn)行分類(lèi)，以便進(jìn)一步尋找差異基因中可能參與免疫調(diào)控的基因及通路蛋白。
　　【結(jié)果】：
　　1、通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，發(fā)現(xiàn)吉西他濱能夠抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1和MIA PACA-2細(xì)胞分泌可溶型ULBP2；而流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果表明，吉西他濱可提高胰腺癌細(xì)胞PANC-1和MIA PACA2表面ULBP2膜型蛋白的表達(dá)。
　　2、通過(guò)建立

5、人NK細(xì)胞系與人胰腺癌細(xì)胞系的共培養(yǎng)體系，并用CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)觀(guān)察吉西他濱對(duì) NK細(xì)胞殺傷胰腺癌細(xì)胞效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抑制培養(yǎng)上清中可溶型sULBP2的分泌表達(dá)后，吉西他濱組NK細(xì)胞的殺傷效明顯高于DMSO對(duì)照組，在培養(yǎng)體系中加入重組的可溶型sULBP2蛋白能逆轉(zhuǎn)NK92細(xì)胞的殺傷活性。
　　3、實(shí)時(shí)定量PCR和western blot結(jié)果表明，吉西他濱能下調(diào)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和MIA PACA-2中ADAM

6、10表達(dá)水平。ADAM10 siRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞PANC-1和MIA PACA-2，有效地沉默PANC-1和MIA PACA-2中ADAM10蛋白表達(dá)水平后，同樣有效地下調(diào)了PANC-1和MIA PACA-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌可溶型ULBP2的水平。
　　4、ELISA檢測(cè)胰腺癌患者血清中 ULBP2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者的血清中sULBP2濃度顯著高于正常健康對(duì)照人群，同時(shí)胰腺癌患者腫瘤組織的免疫組化結(jié)果顯示ADAM10

7、主要分布在腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，不同患者的ADAM10染色程度不同。結(jié)合患者的臨床和病理參數(shù)，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，血清sULBP2濃度與組織中ADAM10表達(dá)呈正相關(guān)。血清sULBP2濃度與CA199（p=0.013），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.009)以及患者總生存期(p=0.045)密切相關(guān)。
　　5、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析處理前后胰腺癌細(xì)胞中環(huán)狀RNA、lncRNA和mRNA的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)72個(gè)環(huán)狀RNA上調(diào)，56個(gè)環(huán)狀RNA下調(diào)；以及1025個(gè)m

8、RNA表達(dá)上調(diào)，656個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào)。通過(guò)生物學(xué)分析，將差異基因按其功能及通路進(jìn)行分類(lèi)，并通過(guò)流行的miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行差異環(huán)狀RNA-miRNA相互作用預(yù)測(cè)，以推斷可以作為”miRNA海綿“的環(huán)狀RNA。
　　【結(jié)論】：
　　1、吉西他濱抑制胰腺癌細(xì)胞ULBP2的蛋白胞外脫落，通過(guò)ULBP2可溶型蛋白與膜蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NK細(xì)胞活化受體NKG2D，從而促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷胰腺癌細(xì)胞。
　　2、吉西他濱下調(diào)胰腺癌表

9、達(dá)ADAM10蛋白酶，從而抑制其對(duì)ULBP2蛋白的蛋白切割。ADAM10 siRNA在轉(zhuǎn)染下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中ADAM10蛋白表達(dá)后，能夠下調(diào)胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌可溶型ULBP2蛋白。
　　3、胰腺癌患者血清中可溶型ULBP2的表達(dá)水平明顯高于正常健康志愿者，且與胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者總生存其有關(guān)。血清中ULBP2表達(dá)水平與患者腫瘤組織中ADAM10表達(dá)呈正相關(guān)。
　　4、通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析了吉西他濱處理前后胰腺癌細(xì)胞中